冻干奶粉样品中大肠杆菌O157和O111的检测方法

应用实时荧光PCR技术建立一种检测冻干奶粉样品中大肠杆菌的方法。通过传统培养法将大肠杆菌O157和O111分离纯化,根据大肠杆菌O157和O111的两对特异性基因rfbE和wbdl设计引物和探针,进行RT-PCR检测;由于该大肠杆菌可能是产志贺毒素大肠杆菌,对STEC的特异性毒力基因stx1、stx2b、eae设计引物和探针并检测。结果表明,该冻干奶粉样品中含有大肠杆菌O157和O111,且致病菌O157检出毒力基因stx1、stx2b、eae,即产志贺毒素与黏附素,致病菌O111检出毒力基因eae,不产志贺毒素而产黏附素。该方法能准确分离大肠杆菌O157和O111,利用实时荧光PCR的高灵敏度和特异性快速检验致病菌及其特异性毒力基因。     

食品中大肠杆菌O157:H7的选择性培养与检测方法研究

为检测食品中的大肠杆菌O157:H7,初步研究了此菌在选择性培养基SMAC、CR-SMAC上的菌落形态,并结合大肠杆菌O157:H7的生理生化特性以及血清学凝集实验对其做了进一步检测,建立了对大肠杆菌O157:H7的选择性培养检测方法.用此法对模拟牛奶样品进行检测,判断检出限为4 cfu/mL.     

芽孢杆菌 BC4 铬抗性相关基因 chrA 的克隆表达

以芽孢杆菌 BC4 菌株为对象，通过对其铬抗性相关基因 chrA 的克隆表达来测定其编码蛋白 ChrA 还原 Cr(VI)的能力以及该蛋白在芽孢杆菌 Cr(VI)去除中的作用，可帮助进一步阐明芽孢杆菌与 Cr(VI)的作用机理，并 为芽孢杆菌应用于铬污染治理奠定理论基础。PCR 扩增出芽孢杆菌 BC4 菌株铬抗性相关基因 chrA，PCR 产物经 克隆与测序，得到 chrA 完整的 DNA 序列。该序列大小为 1182bp，共编码 393 个氨基酸，预测编码蛋白分子量 为 43kDa。根据利用 NCBI 所进行的 BLAST 序列比对结果，判断该基因为铬转运蛋白编码基因。将 chrA 基因 PCR 产物双酶切后连接到表达载体 pET28b 并转化进大肠杆菌 BL21 中，对其表达产物进行分析。结果表明，chrA 基因在大肠杆菌 BL21 中表达约 43kDa 的蛋白，与预期结果相符；重组菌株对 Cr(VI)的耐受能力高于对照菌株， 说明 ChrA 蛋白在芽孢杆菌 BC4 的 Cr(VI)抗性机制中起重要作用，且重组菌株对 Cr(VI)具备较强的抗性。     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

建兰花色调控关键基因的克隆与表达

对建兰花色形成的关键调控基因(CHS)编码区片段克隆至pET28a质粒,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3).SDS-PAGE检测表达产物,针对IPTG浓度、温度与时间等因素,优化其最佳诱导表达条件.结果显示:(1)总RN A提取质量高,经反转录成cDNA,设计引物通过PCR扩增,琼脂糖电泳显示片段为1200 bp;(2)对转化子进行菌落PCR与质粒双酶切鉴定,片段大小均为1200 bp与预计相符,经测序获得片段插入方向正确,未发生突变,可用于蛋白诱导表达;(3)诱导表达优化显示,温度为37℃、IPTG浓度1 mM及诱导时间6 h是重组子(pET28-CeCHS1)在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达的最佳条件.     

临床病原菌耐药性寡核苷酸芯片研究(Ⅰ)——耐药性基因PCR扩增及芯片制备

利用寡核苷酸芯片对临床四种常见的病原菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄葡萄球菌、沙眼衣原体的耐药性基因GyrA片段进行检测.结果表明不管是用荧光素TAMRA修饰的兼并引物还是用荧光素Cy3-dCTP掺入方式在PCR扩增GyrA基因的过程中对PCR产物进行荧光素标记,都可以得到足够的PCR产物用于后续的芯片杂交分析.     

基于自组装及纳米磁球放大的大肠杆菌 O157:H7的压电免疫检测

应用压电免疫传感器快速检测了大肠杆菌O157:H7(E. coli O157:H7).将巯基乙酸(MACA)自组装在AT切向的压电金电极上,以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为反应介质,形成酰氨键固定大肠杆菌抗体.并通过α-甲基丙烯酸(MAA)把抗体修饰在纳米磁球上,采用夹心法将抗原夹在两个抗体间,压电石英晶体交流阻抗(PQCI)和循环伏安法对修饰过程进行了表征,抗原浓度与形成夹心复合物前后的PQCI振动频移相关.其免疫传感器能在3h内检测2×103～8×108 CFU/mL范围内的目标细菌,106CFU/mL情况下重复性实验的RSD在7%以下.     

基于gyrB基因的克罗诺杆菌属菌株PCR快速检测方法的建立

43株克罗诺杆菌属菌株和5株肠杆菌属菌株的gyrB基因被克隆并测序,根据已测序的结果设计了一对特异性引物.经优化后的PCR反应体系只能扩增到43株克罗诺杆菌属菌株的目的片段(438 bp),而无法扩增出其他30株非克罗诺杆菌属菌株.通过系统生物学试验评价得出:该PCR方法的基因组DNA检测灵敏度是1.41 pg/PCR.将56 cfu阪崎克罗诺杆菌菌株ATCC 29544人工污染到3种不同的婴幼儿配方粉中,经人工增菌培养(37℃)6 h后即可扩增到目的片段.将该方法应用于25份实际样品的检测中,结果有3份样品扩增到目的片段.但是经传统的国家标准方法进行检测,只有2份样品检测到克罗诺杆菌属菌株.该方法的建立为快速准确鉴定食品中克罗诺杆菌属菌株提供了一种非常有用的技术手段.     

5-氮杂-2-脱氧胞苷对里氏木霉产纤维素酶的影响

为探究脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)甲基化修饰对丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei,T.reesei)产纤维素酶基因表达的表观遗传调控机制,利用不同浓度(0~1.0 mmol/L)的化学修饰剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5'-Aza)培养T.reesei QM9414.通过测定滤纸酶活性(filter paper enzymatic activities,FPA)和羧甲基纤维素钠酶活性(carboxymethyl cellulose-Na enzymatic activities,CMCA)确定纤维素酶活性的变化;利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测0.1 mmol/L 5'-Aza培养的T.reesei QM9414中纤维素酶基因cbh1、egl1、酶激活因子xyr1基因以及分解代谢阻遏因子cre1与ace1基因的表达水平;通过甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)分析cre1、ace1、cbh1、egl1和xyr1基因上游序列的甲基化状态;利用Western blot和DNA甲基化定量测定分析了DNA甲基转移酶和DNA的甲基化水平.结果显示,0.1mmol/L 5'-Aza处理后的T.reesei QM9414菌株的FPA和CMCA最高,比出发菌株T.reesei QM9414分别高30%和53%;RT-q PCR结果显示,处理后的T.reesei QM9414菌株中纤维素酶基因cbh1、egl1与酶激活因子xyr1基因的相对表达量均高于出发菌株,而分解代谢阻遏因子cre1和ace1基因的相对表达量与出发菌株无明显差异;MS-PCR结果显示,cbh1、egl1和xyr1基因的非甲基化状态高于出发菌株,而分解代谢阻遏因子cre1与ace1基因的非甲基化状态也无明显差异;Western blot和DNA甲基化定量测定结果分别显示,5'-Aza处理后菌株的DNA甲基转移酶表达比出发菌株明显降低,全基因组DNA甲基化程度也有下降.研究结果表明,5'-Aza处理T.reesei QM9414菌株后,纤维素酶活性明显增加,纤维素酶基因cbh1、egl1和激活因子xyr1基因表达水平的增加可能是通过DNA甲基转移酶影响DNA甲基化水平,最终调控基因的表达.     

假单胞菌ZL13邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的克隆表达

寻找新型高效石油降解菌,并研究其相关基因一直是石油降解领域的热点.本文以细菌Pseudomonas sp.ZL13的降解性质粒pZL-1的DNA为模板,通过PCR扩增的方法进行基因克隆,得到邻苯二酚2,3-双加氧酶基因.序列分析结果表明,该基因大小为924bp,编码307个氨基酸;序列同源性比较结果显示,该基因与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因序列的相似性较高,处于同一分支.将目的基因连接到pGEX-4T-2表达载体上,在E.coli BL21中成功表达,转化子具有原油降解能力.     

超声波破碎法提取活性污泥DNA及其DGGE分析

为快速提取活性污泥中的微生物DNA,进一步应用于变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析其群落结构,采用细胞超声波破碎法直接提取反应器活性污泥DNA,以16S rRNA V3区域通用引物进行PCR扩增,随后利用DGGE技术对扩增产物的多样性进行评估.结果表明,超声波破碎法可以快速地提取活性污泥DNA,用超声波破碎法提取到的活性污泥克服了PCR扩增困难的问题.在一定的超声波功率下,超声时间对DNA产率、PCR扩增效率和DGGE分析均有很大影响,实验的最佳超声时间为27 s.DGGE分析表明,用该法提取到的DNA种类较为丰富,多样性较好,种群强度最高能达到0.7 OD,能够进一步应用于群落结构分析.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR检测方法的构建

以管家基因18S rRNA为内参,采用SYBR GreenI荧光染料法,构建了条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR的检测方法,为条斑紫菜HSP90和18S rRNA基因筛选出定量引物各1对,获得的扩增曲线基线平整、指数区明显、斜率大且固定。两基因的熔解曲线显示单特异峰,Tm分别为88.5和85℃。两基因标准曲线的斜率分别为-3.307和-3.308,扩增效率都约为100.6%,Ct值在13～32范围内有良好的线性关系。构建的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强,准确可靠、重复性好,检测周期短,为进一步研究HSP90基因在胁迫下的表达差异奠定了基础。     

基于相关性分析和主成分分析的基因调控网络研究

为了构建基因调控网络模型,提出了相关性分析和主成分分析相结合的方法。利用皮尔逊相关系数进行相关性分析,构造初始的基因调控网络。进而利用主成分分析法确立剪边原则,从而获得新的基因调控网络。采用Dream3中的大肠杆菌（Ecoli1）10个基因的表达数据进行测试,结果表明,参考黄金标准下的基准网络,所提方法获得的基因调控网络具有较高的准确性。     

镉对大肠杆菌生长代谢作用的微量热研究

以大肠杆菌为模型生物，用微量热法研究了镉对大肠杆菌生长代谢作用的影响，并与比浊法进行了比较。实验表明：2种方法结果相近，镉可抑制大肠杆菌的生长，而且镉的浓度越高，对大肠杆菌生长代谢的抑制作用越强。微量热法较传统的比浊法具有独到之处，对于了解镉的生物效应及其对细胞作用的生理特征具有重要的意义。     

基于计算机视觉的食品中大肠杆菌快速定量检测

利用大肠杆菌能发酵乳糖产酸从而使伊红美兰混合液产生沉淀、溶液变色的特性,设计了一套基于颜色特征识别技术的食品中大肠杆菌快速定量检测系统,通过16 h培养后溶液颜色的变化程度来判断待测液中大肠杆菌的数目。系统自动提取发酵后溶液图像的H、I、S颜色分量作为输入向量,自动调用训练好的BP神经网络模型得到大肠杆菌数。试验结果表明:该方法的检测结果与传统方法的相关性好,检测时间在18 h以内,远少于传统方法的6天,有效提高了产品的销售品质。     

新型双臂大环稀土配合物的合成、表征与生物活性研究

本工作用2,6-二甲酰基-4-甲基苯酚和三（3-氨基丙基）胺(trpn)稀土离子存在下通过[2+2]模板缩合反应直接合成了一个新型的双臂大环稀土铒配合物[ErL]ClO4·2H2O。通过元素分析、红外光谱、紫外光谱和电喷雾质谱对其进行表征。通过紫外光谱法、荧光光谱法和凝胶电泳实验考察了配合物与DNA的相互作用。研究结果表明:标题配合物对DNA具有一定的切割活性,且是以插入方式与小牛胸腺DNA结合。同时抑菌毒性实验证实了配合物对大肠杆菌也有一定的抑制作用。     

应用依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测副溶血性弧菌

以副溶血性弧菌的tlh基因为目的片段设计特异性引物,成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋酶DNA恒温扩增技术(HDA)的检测法,进行了特异性和灵敏度实验,并与普通PCR方法进行了比较。该HDA检测方法最低检测限为19.9ng·mL-1,与普通PCR方法相当。副溶血性弧菌的HDA检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。