双酚A单克隆抗体的制备

以双酚酸为起始原料,通过3碳间隔臂联接牛血清白蛋白(BSA),制备了双酚A(BPA)人工抗原1:BPA-C3-BSA。以双酚A为起始原料,在其中一个酚羟基位置通过4碳间隔臂联接BSA,制备了BPA人工抗原2:BPA-C4-BSA。分别将这两种抗原免疫Balb/C小鼠,经克隆、亚克隆后获得稳定分泌细胞株BPA1-6E3和BPA2-4C7。对细胞上清液中的抗体进行鉴定,两株细胞所分泌抗体对BPA的IC50值分别为43.76 ng/mL和3.56 ng/mL。进一步鉴定4C7的IgG亚型为IgG1,轻链亚型为κ,抗体亲和常数为6.2×10~9。抗体与双酚酸的交叉反应率为4.9%,与双酚B的交叉反应率小于0.36%。初步实验表明,该抗体与BPA人工抗原2配对,可用于开发BPA酶联免疫试剂盒。     

抗氨甲酰化蛋白抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

为了制备抗氨甲酰化蛋白抗体,探讨了氨甲酰化与瓜氨酸化之间的关系,开发氨甲酰化蛋白检测试剂盒。以牛血清白蛋白(BSA)和氰酸钾(KCNO)为原料合成人工完全抗原(Hcit-BSA),然后免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,获得抗血清,间接ELISA测定抗体效价,用方阵实验确定抗体最佳稀释倍数和包被抗原的最佳包被浓度,间接竞争ELISA检测抗体特异性。结果表明:抗体效价大于1∶8 000,抗体最佳稀释倍数为1∶4 000,包被原最佳包被浓度为0.25μg/mL,抗体能特异性识别氨甲酰化产物(carbamylation-derived products,CDPs)。Hcit-BSA具有较强免疫原性,使BALB/c小鼠产生抗氨甲酰化蛋白抗体,也为建立一种简便、快速、特异性强的免疫分析方法奠定了基础,为一些疾病的早期快速检测提供了可能。     

恩诺沙星多克隆抗体制备及阻断ELISA检测方法的研究

采用混合酸酐法将恩诺沙星(ENR)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原(ENR-BSA)和包被抗原(ENR-OVA).将免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体(ENR pAb),应用ENR pAb研制ENR残留阻断ELISA快速检测方法,并对其灵敏度、半数抑制浓度IC50特异性、准确度进行测定.结果阻断ELISA的线性检测范围为1～205 ng/mL,灵敏度1 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为11 ng/mL,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均<0.1%,鸡肉样的平均添加回收率分别为87.35%,平均变异系数均<10%.本检测方法具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合ENR残留快速检测的推广应用.     

三聚氰胺单克隆抗体的制备及鉴定

制备了抗三聚氰胺(melamine)单克隆抗体,鉴定了其免疫学特性并建立三聚氰胺标准抑制曲线。以人工合成抗原Melamine-BSA免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术建立分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的细胞株,以体内诱生腹水法生产三聚氰胺单抗,用硫酸钠盐析法提纯,以直接竞争ELISA法建立三聚氰胺标准抑制曲线。获得了1株能稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株H2C6。用间接ELISA方法测定腹水单抗效价为2×10-7。经金标免疫层析实验鉴定单抗与三聚氰胺特异性结合,H2C6杂交瘤细胞株单抗对三聚氰胺的半数抑制浓度(IC50)为4.15μg/mL。除与三聚氰酸交叉反应性为72%外,与三嗪及各类抗生素等交叉反应性都小于5%。体外多次传代培养和反复冻存复苏后抗体分泌稳定。     

硝基苯胺多克隆抗体的制备及鉴定

用合成的免疫抗原硝基苯胺-BSA免疫新西兰大白兔,获得了特异性的硝基苯胺多克隆抗体.最佳包被抗原实验确定了包被抗原最佳浓度(1μg/mL),用间接酶联免疫吸附试验测得抗体效价达1∶12 800.以所获得的抗体建立间接竞争酶联免疫吸附分析法,交叉反应表明,硝基苯胺的特异性抗体与其他类似结构的类似物无明显交叉反应.     

抗禽流感病毒单克隆抗体的研制

以H5亚型禽流感病毒采用长程免疫法免疫的BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,融合率为65.8%.建立间接ELISA,用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体.初检阳性率为14.2%,经2次亚克隆反复筛选获得了2株能稳定分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为5A6,5G7.ELISA证实所获得的单抗是特异性针对H5和H9亚型禽流感病毒的共同表位,5A6,5G7经反复冻存、复苏及多次传代,仍能分泌高效价抗体,乳胶凝集试验证实所分泌抗体均属IgG1,κ型.     

赭曲霉毒素A的抗原设计及在免疫分析中的应用

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一种重要的生物毒素,其广泛存在于谷物和其他植物性食品中。食品中的OTA残留进入人体后会对健康造成危害。为快速便捷地对OTA进行检测,本文以OTA为原料,设计合成了结构更加合理的新的OTA半抗原(OTA-H1),制备了OTA的完全抗原(OTA-H1-BSA, OTA-H1-OVA),并进行了小鼠免疫实验,建立了OTA间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA)。采用核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱对OTA半抗原结构进行表征,结果表明半抗原结构正确;利用OTA-H1-BSA作为免疫抗原免疫Balb/c小鼠,小鼠血清效价为8 000,表明该免疫抗原对OTA具有一定的抑制作用;利用以OTA-H1-OVA作为包被抗原建立的间接竞争酶联免疫分析法检测小麦样品时,IC₅₀为0.04 ng/mL,灵敏度较原有方法提高了30倍。本方法可用于小麦样品中OTA的快速检测。     

食品中磺胺类药物化学发光酶联免疫检测试剂盒的初步研究

在常规酶联免疫法的基础上,将磺胺类母核与牛血清白蛋白合成免疫抗原后免疫小鼠制得磺胺类单克隆抗体,并进一步优化抗体工作浓度、反应时间等实验参数,建立了一种简便、快速、精确的磺胺类残留一步式化学发光酶联免疫检测方法.结果表明该方法最佳检测范围为1.0～81.0 ng/mL,检测IC50达3.047 ng/mL,对猪肉的最低检测限为0.74 ng/g,可检出国际规定的SAs残留标准底限值以下的残留量.与常规ELISA方法相比,检测限和灵敏度基本一致,但反应时间缩短了60 min.证明采用一步式化学发光酶联免疫检测磺胺类残留可以大幅度缩减检测时间,符合快速检测的要求.     

抗3α-HSD单克隆抗体制备方法的初步研究

为了利用杂交瘤技术制备抗3α-HSD单克隆抗体，用表达纯化的3α-HSD作为抗原免疫Balb/c小鼠，获得针对该抗原致敏的B淋巴细胞，并用获得的B淋巴细胞与SP2/0进行细胞融合，得到杂交瘤细胞株，在ELISA间接法筛选出阳性孔的基础上，进行亚克隆，筛选出能稳定分泌抗3α-HSD单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果得到能分泌抗3α-HSD单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备过程中发现很多特殊的现象，如杂交瘤细胞上清与单抗腹水效价过低，但多抗血清效价较高等。文章对在单抗的制备过程中遇到的问题做了初步分析，为之后制备抗3α-HSD单克隆抗体的研究提供技术支持。     

茜素红S-Al(Ⅲ)配合物与牛血清蛋白的相互作用

采用UV-Vis光谱法研究了pH=4.28的缓冲溶液中茜素红S(ARS)-Al(Ⅲ)配合物与牛血清蛋白(BSA)的结合反应.研究发现,ARS-Al(Ⅲ)-BSA的最大吸收波长为510 nm,比ARS红移82 nm,比ARS-BSA红移75 nm,比ARS-Al(Ⅲ)配合物红移74 nm.ARS-Al(Ⅲ)-BSA三元配合物的结合比为nARS∶nAl(Ⅲ)∶nBSA=6∶4∶1,物质的量吸光系数ε为2.65×104L.mol-1.cm-1,ARS-Al(Ⅲ)配合物与BSA作用的条件平衡常数K为8.80×108L.mol-1.ARS-Al(Ⅲ)配合物与BSA之间的作用力主要为配位键和电荷力.     

大豆球蛋白兔源多克隆抗血清的制备及其免疫学特性鉴定

为建立大豆球蛋白致敏原检测方法和蛋白致敏性亚基的表位定位,从脱脂豆粉中分离纯化大豆球蛋白,制备多克隆抗血清,并进行免疫学特性分析。大豆球蛋白等电点pH值为6.4,采用碱溶酸沉法对大豆球蛋白进行粗提,用Sepharose CL-6B层析纯化大豆球蛋白粗提物,用SDS-PAGE检测蛋白纯度,免疫新西兰兔制备多抗血清,并对血清进行免疫学特性鉴定。结果表明:1号兔效价达到1∶6×10^4,由间接竞争ELISA抑制曲线可知,半数抑制率IC50为527 ng/mL,1号兔的多抗血清敏感性最高。特异性测定结果表明,该多抗血清除了与β-伴大豆球蛋白和花生蛋白的交叉反应率为8.6%和4.6%,与其他蛋白交叉反应率均小于0.2%。制备的兔源多抗血清效价高、敏感性强、特异性好,为大豆球蛋白单克隆抗体的制备及大豆蛋白致敏性亚分子结构的定位奠定了基础。     

基于纳米金和辣根过氧化物酶信号放大的 癌胚抗原电化学免疫传感器

以癌胚抗原(CEA)为检测目标构建CEA电化学免疫传感器:壳聚糖为生物活性膜,纳米金和生物素标记的辣根过氧化物酶为放大元,CEA、链霉亲和素标记的癌胚抗体免疫反应形成的复合物为固定的酶标免疫复合物,并对检测条件进行了优化。通过竞争性酶联免疫法检测不同浓度CEA的电化学响应。结果表明,该新型免疫传感器表现出良好的线性范围(4～16 ng/mL,R2=0.992 7),检测限为1 ng/mL。     

氟苯尼考残留的酶联免疫检测方法的研究

对氟苯尼考进行结构改造制备半抗原及抗原,免疫家兔得到多克隆抗体。经测定,该抗体对氟苯尼考和氟苯尼考胺均有反应,且灵敏度较高,效价达到1∶480 000;在此基础上通过对各实验条件参数的优化建立了间接竞争酶联免疫检测方法,该方法检测限为0.5μg/kg,以20,50μg/kg进行空白样品添加实验,回收率为82.5%～96.0%,批间变异系数在4.1%～15.2%,可初步用于动物组织样本中氟苯尼考残留的检测.     

两种胶体金制备方法的比较研究

通过控制还原剂的加入量(20 mL 0.01％四氯金酸溶液中1％柠檬酸钠和抗坏血酸添加量分别为300μL与400 μL),利用柠檬酸钠和抗坏血酸还原两种方法制备得到了平均粒径为20 nm的胶体金颗粒,并对其进行了抗体标记比较研究.结果显示:抗坏血酸还原法制备得到的胶体金标记的蛋白量为15.18 μg/mL(蛋白质量/胶体金体积,下同),高于柠檬酸钠还原法的5.07 μg/mL,间接ELISA法测得其效价(1∶800)也比柠檬酸钠还原法制备的颗粒标记物高(1∶400),这表明抗坏血酸还原法更适合于标记用胶体金颗粒的制备.     

PD-1抗体表达载体的构建以及其功能的探究

通过构建含PD-1抗体基因的重组腺病毒表达载体Ad35-anti-PD-1,表达的PD-1抗体以探究其对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗肿瘤功能的影响。用ELISA实验检测Ad35-anti-PD-1在293细胞中PD-1抗体的表达量;利用Protein G亲和层析法纯化PD-1抗体;通过体外杀伤实验研究PD-1抗体阻断PD-1信号通路的CTL杀伤肝癌细胞能力的变化。显示成功构建重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1,滴度为1×1010 pfu/mL;ELISA实验检测在72h时293细胞上清中PD-1抗体的表达量约在600ng/mL;Westernblotting实验证明PD-1抗体包含正确的重链（50kD）和轻链（25kD）;ELISA实验检测从100mL细胞上清中得到1mL浓度在40μg/mL的PD-1抗体;体外杀伤实验证明CTL在添加PD-1抗体的环境中杀伤肝癌细胞的能力显著增强。     

Determination of Stereoisomers of Epalrestat by Liquid Chromatography

An isocratic reversed-phase liquid chromatographic (LC) method is described for the determination of epalrestat and its three stereoisomers (degradation impurities) in drug substance. The LC separation system consisted of a Hypersil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase comprising methanol, acetonitrile and water (volume ratio 60∶1∶50, pH 4.5) delivered at a flow rate of 1.6 mL/min and UV detection at 280 nm. The proposed LC method is simple and selective for the determination of the stereoisomers of epalrestat in the drug substance with a limit of detection and quantification of 3.9 μg/mL and 4.9 μg/mL, respectively. The stereoisomers were identified by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).     

微波消解-MPT-AES法测定电池污染土壤中铅和汞

研究了用微波消解-MPT-AES法测定电池污染土壤中铅、汞含量的方法。考察了分析谱线、微波前向功率、载气流量、工作气流量和氧屏蔽气压力对铅、汞发射强度的影响,得出最佳实验条件。分析介质酸及共存离子对铅、汞测定的影响。实验结果表明,铅、汞的检出限分别为25.2,420.5 ng/mL,RSD(n=11)分别为1.8%和4.9%,并且测得它们的线性范围分别为0.1~100,5~100μg/mL。采用正交实验设计考察最佳土壤微波消解条件,采用工作曲线法测定其中铅、汞的含量,加标回收率分别为99.57%~100.03%和97.32%~98.24%。微波消解-MPT-AES法可成为测定电池污染土壤中铅、汞含量的行之有效的分析方法。