蛙病毒三重荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中收录的蛙病毒属虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计了一对通用引物和3条Taqman探针,通过PCR反应体系的优化以及反应的特异性、灵敏性和干扰性试验,建立了一种可检测蛙病毒属大部分成员并能进行初步分类的三重荧光PCR方法。通过鉴定分析将蛙病毒属成员分为三类,其中第一类包括蛙病毒3型(FV3)、饰纹汀蛙虹彩病毒(BIV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、欧洲鲴鱼病毒(ECV)、欧鲶病毒(ESV)、中华鳖虹彩病毒(STIV)、大鲵虹彩病毒(ADIV)、沼泽绿牛蛙虹彩病毒(RGV)和虎纹蛙病毒(TFV),第二类是Santee-Cooper蛙病毒(SCRV),由大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)、裂唇鱼病毒(DFV)和孔雀鱼病毒(GV6)组成,而新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)则单独作为第三类。进一步分析发现各病毒的最低检测量均达到10~2拷贝,表明该方法除了具有良好的特异性和稳定性之外还具有高度灵敏性。建立的该蛙病毒三重荧光PCR方法可为蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调查提供一种有效的技术手段。     

海水附着细菌多样性和群落演替的研究

通过细菌16S rRNA基因(16S rDNA)文库方法研究了1至7天近海浸海玻片附着细菌的多样性和群落演替特征.从1至7天3个基因文库中共筛选了269个克隆、144个有效分类操作单元 (OUT)并对其全部测序.16S rDNA序列系统进化分析发现,这些细菌主要归属于8个细菌门类:变形菌门(Proteobacteria)(α-、γ-和δ-亚群)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门(Planctomycetes) 、光合细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacter ia).由此可知1周内变形菌门的α-亚群、γ-亚群和拟杆菌门的细菌是常见的附着类群;α-变形菌亚群中的玫瑰杆菌族(Roseobacter clade)是海洋环境中比较常见的早期附着种类;由聚类分析显示3天和7天细菌的群落结构相似.这些实验结果为了解海水附着细菌生物膜形成的演替过程提供了理论基础,并为海水微生物腐蚀控制提供了生物学线索.     

几种帘形目贝类rDNA ITS序列的比较

扩增并测序了4种帘形目和1种蚶目贝类(外群)核糖体DNA的转录间隔区(ITS)序列.帘形目贝类序列长度在874bp到1466bp之间,GC含量在62%到67%之间,ITS序列在相近的3种帘蛤科贝类之间表现出长度保守性和碱基组成的相似性.采用ITS1,ITS2,以及ITS1与ITS2的连接序列进行聚类,结果表明:2种蛤仔聚为一枝,表现出较近的亲缘关系,帘蛤科的3种贝类聚在一起,再与同属帘形目的缢蛏相聚.研究的结果揭示了帘形目贝类的系统发生关系.     

16SrRNA基因测序确定根瘤菌的系统发育

采用聚合酶链反应和ＤＮＡ测序技术分析了两个新根瘤菌群的代表菌株的部分１６ＳｒＲＮＡ基因序列，并对所得序列进行了聚类分析。在系统发育树状图中，菌株ｓｈ２２６２３所代表的根瘤菌群与菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌及发根土壤杆菌等构成一个亚群，另一个菌群的代表菌株ｓｈ１９３１２与土壤杆菌的３个种构成一亚群。这些结果初步确定了两菌群的系统发育地位，并提示了根瘤与土壤杆菌两属间进化上的密切关系。     

花鲈肿瘤坏死因子基因及其在LPS和病毒刺激下表达的研究

采用同源克隆和锚定PCR技术，从花鲈(Lateolabrax Japonicus)中克隆到肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNFα)cDNA的全序列。花鲈TNFα的cDNA全长990bp，3′非编码区域(UTR)为192bp，5′UTR为72bp，开放阅读框(ORF)为723bp，可编码241个氨基酸，分子量大约为26kDa。同源性分析表明该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的TNFα基因具有很高的相似性，并含有TNF家族的签名序列(signature)。同时，利用RT—PCR技术，对不同刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行了初步研究，发现TNFα基因在未受刺激鱼体的头肾和脾脏中有明显的表达。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和虹彩病毒(Iridovirus)都可以诱导TNFα基因高水平的表达，但是在不同组织内的表达存在差异。LPS刺激后表达较强的组织是头肾和睥脏，而病毒感染后TNFα在盱脏中的表达较强。研究结果表明花鲈TNFα基因存在组成型和诱导型两种表达调控机制，在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

大菱鲆病毒性疾病研究进展

综述了感染名贵经济鱼类大菱鲆的各种病毒性疾病，包括大菱鲆虹彩病毒病、淋巴囊肿病毒病、疱疹病毒病、大菱鲆呼肠孤病毒病、传染性胰脏坏死病毒病、病毒性脑病和视网膜病、病毒性出血性败血症和病毒性红细胞感染症等。分别介绍了这些病毒性疾病的病原种类和特征，疾病的流行病学、病理学、诊断和防治以及研究进展。最后概述了我国大菱鲆疾病研究的现况以及在我国养殖大菱鲆中发现的一种可能是新的大菱鲆虹彩病毒样病原。     

大菱鲆MHCⅡB基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,得到了1297bp的大菱鲆MHCⅡB全长cDNA片段.该序列包括741bp的开放阅读框(ORF),35bp的5'末端非编码区(UTR)以及521bp的3'末端非编码区.序列比对结果表明,大菱鲆MHCⅡB与牙鲆MHCⅡB的同源性高达71.5%,与真鲷、鲈鱼和丽鱼的同源性分别为67.1%,70.7%和68.4%,与人、鼠和鲨鱼MHCⅡB的同源性仅分别为24.1%,25.1%和13.2%.组织表达研究显示,MHCⅡB基因在正常大菱鲆组织中均表达,但表达量在各个组织中不同,其中较强的表达于鳃、脾、头肾、小肠中,中等程度表达于血、心脏和皮肤,在肝、性腺和肌肉中表达最弱.     

军曹鱼淋巴囊肿病毒的系统关系研究及基因型分析

从患淋巴囊肿病的养殖军曹鱼肿瘤中分离到一种虹彩病毒,命名为淋巴囊肿病毒军曹鱼分离株(LCDV-rc).为探讨LCDV-rc的系统地位,从DNA水平上分析了该病毒株与淋巴囊肿病毒中国牙鲆分离株(LCDV-cn)、淋巴囊肿病毒韩国鲈鱼分离株(LCDV-sb)、淋巴囊肿病毒日本牙鲆分离株(LCDV-jf)、淋巴囊肿病毒欧洲分离株(LCDV-1)和淋巴囊肿病毒日本岩鱼分离株(LCDV-rf)的系统关系.以核衣壳蛋白(MCP)基因为分子标记,通过PCR扩增和克隆测序获得了长度为1356bp的含178个信息位点的mcp基因序列;用最大简约法、最大似然法、邻接法和Bayesian法构建了分子系统树并进行了置信度检验.结果表明,构建的淋巴囊肿病毒ML、NJ、MP和Bayesian系统树的拓扑结构一致,LCDV-rc和LCDV-sb聚为一支,LCDV-cn和LCDV-jf聚为一支,LCDV-1和LCDV-rf分别各为一支.在35种虹彩病毒的系统关系分析中,LCDV-rc与另5株淋巴囊肿病毒在系统树上聚为一大支,说明LCDV-rc与淋巴囊肿病毒的关系近于其他虹彩病毒.根据遗传距离和系统关系分析认为,LCDV-rc属于一种新的基因型,称其为淋巴囊肿病毒Ⅳ型基因型.     

大菱鲆神经肽Y基因克隆及其在工厂化养殖饥饿-投喂策略中的表达特征分析

本文通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和末端快速扩增技术(RACE)克隆了大菱鲆神经肽Y(NPY)基因全长为729 bp的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列,其中5′非翻译区(5′-UTR)为70 bp,3′非翻译区(3′-UTR)为359 bp,开放阅读框(ORF)为300 bp。ORF编码含有99个氨基酸的蛋白质多肽,N端28个氨基酸为信号肽,信号肽后是由36个氨基酸组成的NPY成熟肽。针对大菱鲆NPY蛋白质与其他物种的同源性进行比较,结果显示大菱鲆NPY与其他物种的同源性在53.9%～98%,特别是与同属于鲆鲽鱼类的牙鲆和美洲拟鲽的同源性高达97%～98%,表现出很高的保守性。采用实时定量PCR对大菱鲆NPY基因的表达特征进行分析,结果表明,大菱鲆NPY基因在神经组织和外围组织中都有表达,其中在下丘脑中的表达量最高。饥饿实验中,随着饥饿的进行,NPY的表达量显著变化(P0.05),呈现先升高再降低,再显著升高并维持一段高水平表达后,再次下降的趋势,饥饿后再投喂会使NPY的表达量升高,并且饥饿时间越长,再投喂后NPY的表达水平越高,但是再投喂2 h后表达量还会再次下降至相似的水平,这都预示着NPY是一种摄食刺激因子,并且是一种短期的调控机制。     

胖尾刺虫 (纤毛门,旋毛纲,下毛目)16s小亚基单位核糖体RNA基因的序列测定及其系统地位初探

对分离自青岛沿岸的下毛目纤毛虫-胖尾刺虫(Uronychia transfuga)的16s小亚基单位核糖体RNA(16s-like Small Subunit rRNA)基因进行了序列测定,通过与目内其它相近属多种纤毛虫的比较分析,认为游仆虫属(Euplotes)首先从下毛目中分离出来,其次是属刺虫属和双眉虫属(Diophrys),其间邻近的遗传距离共同构成了下毛目内最为进化的类群-游仆亚目(Euplotina).同时,序列分析也支持该目其它三个亚目的划分散毛亚目(Sporadortrichina),排毛亚目(Stichotrichina)和尾柱亚目(Urostylina).这与形态学资料是吻合的.     

海湾扇贝g型溶菌酶基因cDNA的克隆与分析

通过EST和锚定PCR技术,从海湾扇贝(Argopecten irradians)中克隆得到一种溶菌酶基因的全长cDNA(全长659bp,编码200个氨基酸)。BLASTx分析的结果显示,它和脊椎动物g型溶菌酶相似性较高,却不同于无脊椎动物中已发现的c型和i型溶菌酶。在其编码的氨基酸序列中发现了g型溶菌酶的活性中心(Glu82,Asp97,Asp108),同时6个保守的半胱氨酸也与鸟类和鱼类的g型溶菌酶相一致。结合BLASTX分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是一种在无脊椎动物中首次发现的g型溶菌酶的编码序列。采用Clustalw软件,对多种脊椎动物c型、g型溶菌酶和无脊椎动物c型、i型溶菌酶以及本研究发现的无脊椎动物g型溶菌酶进行了分析,结果发现,无脊椎动物c型、i型溶菌酶和脊椎动物c型溶菌酶同源性较高,而海湾扇贝g型溶菌酶和脊椎动物g型溶菌酶同源性较高。由此说明c型、g型溶菌酶从无脊椎到脊椎动物的进化是平行发生的,这对进一步研究溶菌酶及其分子进化具有重要意义。     

16S rRNA基因与16S-23S rRNA转录单元内间隔区序列分析及其在节旋藻和螺旋藻分类鉴定中的应用

测定了节旋藻属3个品系和螺旋藻属1个品系的全长16SrRNA基因基因和16S rRNA转录单元内间隔区序列（ITS）,分析了已知的节旋藻、螺旋藻和相关品系的相应序列的同源性,构建了系统发生树,并评价了这两段DNA序列在节旋藻、螺旋藻种属分类和种质鉴定中的意义。结果表明：（1）16SrRNA基因序列和ITS序列均可用于节旋藻属和螺旋藻属的属间分类,以两序列为基础的系统学分析结果一致;（2）ITS序列变异程度高于16SrRNA序列,适用于节旋藻和螺旋藻属内品系或种质鉴定;（3）节旋藻属可明确界定,16SrRNA基因序列相似性大于98％,ITS序列相 似性大于88％;（4）螺旋藻属某些品系间16SrRNA序列和ITS序列相似性较低,与不同属间的序列相似性程度为同一水平。     

外来入侵生物福寿螺β-actin基因片段的克隆及表达分析

采用RT-PCR的方法首次对入侵我国福寿螺的β-actin基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并通过氨基酸序列分析推导与其他相关物种的亲缘关系.结果表明,获得的福寿螺β-actin基因cDNA片段大小为840bp,核酸编码有280个氨基酸序列,与其他物种具有高度的同源性.通过邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,福寿螺首先与软体动物聚为一簇,然后与节肢动物聚为一簇,再与脊椎动物聚为一簇.此外,RT-PCR结果显示,β-actin基因在福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉等4个组织内的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers

A new method for phylogenetic classification of bacterial strains using matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) is proposed. This method was developed using a bioinformatics-based approach to the rapid identification of bacteria as previously proposed by Demirev and co-workers, which uses ribosomal proteins composed of approximately 50 subunit proteins as biomarkers. Although the amino acid sequences of ribosomal proteins are highly conserved, slight sequence variations can occur at the strain level. Since ribosomal subunit proteins are a complex of housekeeping proteins that have different phylogenetic evolution rates, sequence variation detected as mass differences by MALDI-MS may be useful for the phylogenetic classification of bacteria at strain level. In our proposed method, the first step is the selection of reliable biomarkers through characterization of the expressed ribosomal subunit proteins of a reference strain (usually a genome-sequenced strain) by MALDI-MS. The observed masses in the MALDI mass spectra of cell lysates of sample strains are then compared with the biomarker masses of the reference strain. The biomarkers for each sample strain were designated as present or absent at the reference masses, indicated by 1 or 0, respectively, which were summarized in a table. This table is processed by cluster analysis, generating a phylogenetic tree. In this study, the success of this approach was confirmed by classification of Pseudomonas putida strains because its classification is much more complicated than that of other bacterial strains. Forty-three reliable biomarkers were selected from ribosomal sub-unit proteins of a genome-sequenced strain, P. putida KT2440. The numbers and kinds of biomarkers observed for 16 strains of P. putida, including different biovars, were markedly different, reflecting the variety of the strains. The classification results by the proposed method were highly comparable to those based on the DNA gyrase subunit B gene (gyrB) sequence analysis, suggesting our proposed method would be a useful high-throughput method for phylogenetic classification of newly isolated bacteria.     

鲈鱼蛋白质感染因子蛋白基因的克隆和结构分析

采用RT-PCR方法分离了鲈鱼蛋白质感染因子蛋白编码基因序列,并进行了结构分析。研究证明,该感染因子蛋白由507个氨基酸组成,与红鳍东方、大西洋鲑蛋白质感染因子蛋白的平均相似性为67．9％,预测分子量约54kD,具有信号肽、短肽顺接重复、疏水区、糖基化位点、二硫键、糖基缩醛磷肌醇锚定位点等蛋白质感染因子蛋白的主要特征结构域。鲈鱼蛋白质感染因子蛋白编码基因序列的分离,为蛋白质感染因子的进化、功能研究以及可能存在的鱼类传染性海绵样脑病研究奠定了基础。     

牙鲆与大菱鲆病原迟钝爱德华氏菌生物学特性及系统发育学分析

对从7起牙鲆（Bastard halibut,Paralichthys olivaeeus L．）、3起大菱鲆（Turbot,Scophdudmus maximus L．）病害的病（死）鱼中分离到的相应病原菌较系统地进行了形态特征、理化特性等表观分类学指征的鉴定及代表菌株DNA中G＋Cmol％的测定。同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树。结果表明,分离鉴定的148株菌均为爱德华氏菌属（Edwardsiella Ewing and McWhorter 1965）的迟钝爱德华氏菌（E．tarda）,其中128株为迟钝爱德华氏菌野生型（E．tarda wild type）菌株,20株暂定为迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株。代表菌株（HC010907—1及HC010830-1）的16SrRNA基因序列,与GenBank数据库中的迟钝爱德华氏菌的同源性均在99％。     

Positive selection on D‐lactate dehydrogenases of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus

Lactobacillus delbrueckii has been widely used for yogurt fermentation. It has genes encoding both D‐ and L‐type lactate dehydrogenases (LDHs) that catalyse the production of L(+) or D(−) stereoisomer of lactic acid. D‐lactic acid is the primary lactate product by L. delbrueckii, yet it cannot be metabolised by human intestine. Since it has been domesticated for long time, an interesting question arises regarding to whether the selection pressure has affected the evolution of both L‐LDH and D‐LDH genes in the genome. To answer this question, in this study the authors first investigated the evolution of these two genes by constructing phylogenetic trees. They found that D‐LDH‐based phylogenetic tree could better represent the phylogenetic relationship in the acidophilus complex than L‐LDH‐based tree. They next investigated the evolutions of LDH genes of L. delbrueckii at amino acid level, and found that D‐LDH gene in L. delbrueckii is positively selected, possibly a consequence of long‐term domestication. They further identified four amino acids that are under positive selection. One of them, V261, is located at the centre of three catalytic active sites, indicating likely functional effects on the enzyme activity. The selection from the domestication process thus provides direction for future engineering of D‐LDH.Inspec keywords: enzymes, biochemistry, molecular biophysics, microorganisms, genetics, evolution (biological), molecular configurations, isomerism, food products, biological techniques, fermentationOther keywords: Lactobacillus delbrueckii, D‐lactate dehydrogenases, yogurt fermentation, Streptococcus thermophilus, lactic acid stereoisomer, phylogenetic trees, acidophilus complex, amino acids, enzyme activity, three‐dimensional structure, L‐LDH genes, D‐LDH genes     

华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

通过3次PCR程序克隆得到了华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶全基因序列,该基因的开放阅读框长1170bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质,包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%.在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分泌表达前导肽序列.SDS-PAGE分析表明表达蛋白的分子量约37kD.N-端氨基酸序列分析表明该重组蛋白分泌过程中前导序列N-端的67个氨基酸被切割掉,表达的重组脂肪酶由前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸组成.发酵132h后上清中重组脂肪酶的表达量最高,蛋白含量约5.4mg/mL,橄榄油乳化法测水解酶活为161U/mL,其比活比野生型华根霉脂肪酶高约43倍.     

赤潮生物原甲藻Prorocentrum分子识别和系统发育学研究

对东海原甲藻Prorocentrum donghaiense、海洋原甲藻P.micans、微小原甲藻P.minimum、立玛原甲藻P.lima(CCMP1966)四种赤潮生物的18S rDNA进行了PCR扩增和全序列测定及分析,比较了它们的遗传距离和相似系数,获得其18S rDNA序列中的三处高变异区,为设计快速识别原甲藻种间分子探针提供分子依据.同时结合12种具有代表性的重要赤潮甲藻的18S rDNA序列,采用邻接法(Neighbour-Joining,NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood,ML)构建系统发育树,研究原甲藻的种间关系和进化地位,结果表明,营底栖生活的P.lima与营浮游生活的P.micans、P.minimum、P.donghaiense为多系起源,浮游型原甲藻与凯伦藻Karenia有更近的起源关系.     

天山根瘤菌(R.tianshanense)模式菌株16SrDNA全序列测定及其系统发育

对天山根瘤菌群的模式株A－IBS（＝CCBAU3306）16SrDNA的全序列进行了测定，以确定它在系统发育中的地位。实验中设计了6个引物，通过聚合酶链反应扩增天山根瘤菌模式菌株A－IBS的16SrDNA。应用DNA定向测序技术，获得了菌株A－IBS的16SrDNA全序列，将所得序列与根瘤菌已知种的模式菌株16SrDNA全序列一起进行聚类分析，得到了系统发育树状图。在树状图中，菌株A－IBS所代表的根瘤菌群与华癸根瘤菌（R．huakuu）群、鹰嘴豆根瘤菌（R.ciceri）群、地中海根瘤菌（R．mediterrranean）群及百脉根根瘤菌（R．loti）群的亲缘关系较近，与其它根瘤菌群的亲缘关系较远，存在着属水平的差异，表明了这些相近根瘤菌群构成了根瘤菌的一个独立的发育系。