蜡样芽孢杆菌ERIC-PCR分子分型方法的建立

为建立简单快速的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)的分子分型方法,该研究以B.cereusCMCC 63303的基因组DNA为模板,并采用正交设计L16(45)对影响ERIC-PCR反应体系的五个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物)在四个浓度水平上进行优化,并通过单因素试验确定最佳退火温度,最后以优化后的反应体系对50株B.cereus分离株进行ERIC-PCR分子分型和聚类分析验证其稳定性和分型效果。结果显示应用建立的ERIC-PCR反应体系对50株分离株扩增均得到了9-17条、大小在200-4000 bp之间的条带,并可将其分为47个型,且分辨力达到0.996,具有较高稳定性和分辨能力。表明ERIC-PCR技术对B.cereus分型,具有简便和分辨力高等优点,可用于食源性B.cereus分离株的多样性研究。     

151株副溶血性弧菌的分子分型研究

目的 了解辽宁省副溶血性弧菌的分布规律及流行趋势，为辽宁省副溶血性弧菌引起的食源性疾病的溯源和预警提供基础。方法 对2019年辽宁省151株VP分离株进行血清分型、PFGE、REP-PCR和ERIC-PCR分子分型和聚类分析，评价3种方法间的关联性，同时探讨菌株间的亲缘关系。结果 124株分离株可共分为18个血清型，27株分离株未能分型，血清群以O3群、O1群和O2群为主。PFGE的分辨力（DI）为0.97,REP-PCR的DI为0.95,ERIC-PCR的DI为0.93。血清型O3群菌株与O1群菌株分子型相似度高。结论 2019年辽宁省临床VP分离株流行血清型仍为O3:K6，食品VP分离株流行血清群仍为O2。PFGE、REP-PCR和ERIC-PCR 3种分型方法结果一致，且PFGE分型方法的分辨力和再现性均优于其他两种方法，研究结果可以为副溶血性弧菌所引起食源性疾病的溯源提供新的技术手段。     

食源性单增李斯特菌的ERIC-PCR和Sau-PCR分型研究

对从广州市天河区超市和菜市场及厦门某食品加工厂分离得到的单增李斯特菌进行ERIC-PCR和Sau-PCR检测,进行溯源研究及遗传多样性分析。ERIC-PCR将22株单增李斯特菌共分为8个基因型,其中以h型为主,共有8株菌。Sau-PCR方法将这批菌分为7个基因型,主要型别为E型和G型,二者共占50%。两种分型方法的结果呈现出一定的差异与关联,使用两种不同分型方法进行综合分析,有助于更好地认识单核细胞增生李斯特菌(LM)菌株间的遗传关系和流行病学特点。     

副溶血性弧菌ERIC-PCR分型及毒力基因检测研究

目的:建立副溶血性弧菌ERIC-PCR分子分型技术,分析副溶血性弧菌标准菌株及分离株基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱,并对副溶血性弧菌毒力基因进行检测,以了解不同来源副溶血性弧菌毒力基因携带情况.方法:提取副溶血性弧菌基因组DNA,以肠杆菌基因间共有重复序列(ERIC)为引物进行PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪对图谱进行观察分析,并以相似性系数构建聚类图;通过PCR方法对直接耐热溶血素(TDH)和耐热直接相关溶血素(TRH)进行检测.结果:26株副溶血性弧菌均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,ERIC-PCR可将26株菌分为12个型,分辨力指数为0.926;只在临床分离株中检测到TDH基因,而除一株标准菌株外,所有菌株都未检测到TRH基因.结论:研究显示ERIC-PCR可从分子水平对副溶血性弧菌基因组DNA进行快速指纹图谱分析,同时结合毒力基因检测,能够为副溶血性弧菌食物中毒疾病的预防和流行病学调查提供科学依据.     

珠江三角洲地区副溶血性弧菌遗传多样性和致病性相关研究

副溶血性弧菌(Vibiro parahaemolyticus)是一种常见的食源性致病菌,本文研究了珠江三角洲地区副溶血性弧菌的遗传多样性。从54株副溶血性弧菌出发,研究了它们的API20E生化反应、抗生素耐药性、O抗原血清型,进行了ERIC-PCR分子分型,并检测了两种毒力基因tdh和trh的分布。54株副溶血性弧菌可被分为6个生化反应类群,主要类群为Biochem-A;菌株对萘啶酮酸、环丙沙星、氯霉素均不耐药,而对氨苄青霉素耐药率最高,耐药率0.88;O抗原血清型分别为O1、O2、O3、O4、O5、O6、O8、O10、O11,O2为主要血清型,O3为临床主要血清型;ERIC-PCR分子分型将54株菌分成47个型别,ERIC-PCR图谱相似性大于0.80的类群有12个,没有明显的优势类群;有12株副溶血性弧菌为tdh阳性,阳性率为0.22,其中10株为临床来源菌株;有2株副溶血性弧菌为trh阳性,阳性率为0.04,均为食品分离株。珠三角地区食品和临床来源的副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性。     

ERIC-PCR及全自动核糖体分型法鉴定不同来源的解朊金黄杆菌

目的:为了建立一种高效分离筛选高产蛋白质谷氨酰胺酶的解朊金黄杆菌的筛选方法,采用肠道基因间重复序列扩增(ERIC-PCR)和全自动核糖体分型方法对来自不同环境的33株解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)进行分子分型研究。方法:采用ERIC国际通用引物对33株解朊金黄杆菌进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测,使用NTsys软件对电泳图进行聚类分析。同时,采用全自动核糖体分型方法对33株解朊金黄杆菌进行核糖体分型,采用Bionumeric软件对菌株进行聚类分析。结果:两种方法均可得到清晰的指纹图谱,可对33株解朊金黄杆菌进行分子分型。ERIC-PCR可扩增出3~9个100~10000 bp之间的条带,将菌株分为2个族群。全自动核糖体分型方法可将菌株分为2个亚型,每种亚型间菌株仍有细微差异。结论:同种菌株之间同源性达到99%以上,但仍在遗传进化关系上存在差异。来自同一地区的分离株有聚类成一类的趋势,且与菌株的产酶能力存在密切关联。研究结果表明聚类于族群Ⅱ的菌株基本都来自于河南,且该类群菌株的产酶能力明显高于族群Ⅰ。     

变性梯度凝胶电泳技术在食源性沙门氏菌分子分型中的应用研究

目的建立基于变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术的沙门氏菌分型方法。方法以5株代表性沙门氏菌为供试菌,用引物对GC-rpoB1/ropB3R扩增获得目的片段后,经变性凝胶电泳分离获得谱图,量化分析谱带多样性及均一性,依据菌株谱图量化相似性构建聚类分析图,分析该技术用于沙门氏菌分型的可行性。结果 5个供试菌的PCR-DGGE谱图差异大,其中以标准菌株肠炎沙门氏菌(ATCC9184)的多样性及丰富度最高,标准菌株鼠伤寒沙门氏菌的最低;就谱带相似性而言,分离自鸭腿样品的2株沙门氏菌的相似性最高,戴斯系数高达85.7%,而分属于不同血清型的两个标准菌株则相似度指数为0%;基于谱带相似性建立的聚类树可将供试菌株很好地分为不同簇。结论本研究所建立的基于PCR-DGGE技术的沙门氏菌分型方法准确度和分辨力均较理想,具有一定的理论及实际意义。     

肉类及蔬菜食品中EHEC O157污染分布及分型研究

为深入了解肉类及蔬菜中肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC O157)的污染分布规律和遗传多样性,随机采集全国18个城市的食品样品,参考GB/T 4789.36-2008方法进行样品处理,并用rfbE/fliCH7双重PCR对菌株进行鉴定;分别采用单重PCR和ERIC-PCR对菌株进行毒力基因(eae、hlyA、stx1和stx2)检测和分子分型。结果表明,414份样品中检出18份EHEC O157阳性样品,总污染率4.35%,其中生鲜肉12份,速冻肉6份,蔬菜未检出;经过生化、血清鉴定和双重PCR检测,鉴定出52株EHEC O157,包括29株O157:H7,3株O157:NM(fliCH7+,无动力),2株O157:NM(fliCH7-,无动力)和18株O157:hund(未确定H型);毒力基因检测结果发现,52株菌株中有50株携带毒力基因,其中40株(76.92%)携带eae,31株(59.62%)携带hlyA,20株(38.46%)携带stx1,24株(46.15%)携带stx2。ERIC-PCR分型结果表明,在相似系数为0.80时,菌株可分为12个聚类簇,F型为其主要基因簇,分离株的基因型呈现多样性。     

单核细胞增生李斯特菌食品分离株的分子分型鉴定

单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性条件致病菌,不同亚型菌株的致病力存在较大差异。本文以86株单核细胞增生李斯特菌食品分离株为研究对象,采用多重PCR的血清分型方法 ,将这些分离株分为3个血清组,即:1/2a或3a(72.1%,n=62),1/2b或3b或7(19.8%,n=17),1/2c或3c(8.1%,n=7)。采用ERICPCR亚分型方法 ,将这些分离株和4株标准菌株分为10个类群。对比ERIC-PCR的指纹图谱与血清分型结果 ,两者呈现较高的相关性。将血清分型和ERIC-PCR方法相结合,可实现不同来源单核细胞增生李斯特菌食品分离株的同源性分析。这些分型结果为该菌的流行病学调查提供数据支持。     

不同培养基及培养条件对单增李斯特菌ERIC-PCR分子分型的影响

本研究以实验室保存的26株李斯特氏菌为实验对象,通过ERIC-PCR和凝胶电泳技术对其展开基因分型,并根据分型结果选取不同亚型菌株,进而考虑改变细菌培养条件来探究不同培养基对李斯特菌ERIC-PCR分子分型结果的影响。实验结果初步表明,实验室26株李斯特菌至少可分成11个主要基因类群,其中Ⅰ型菌株最多占有8株,而Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ以及Ⅺ型均最少,各占1株;同时发现,培养基及培养条件的改变会对LM87、LM109(野生型单增李斯特菌)分型结果产生影响,且这些菌株分型均最少。由此推断,不同的营养机制和培养条件可能会对李斯特菌的基因组稳定性或基因表达带来潜在影响,因此无论是在对LM致病机理的基础研究过程中还是对其进行分子分型鉴定,都必须考虑其寄主来源以及培养条件。     

椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性分型方法的建立

目的 建立椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性(FAFLP)分型方法,并对4株模式菌株和19株分离菌株进行分型.方法 选用4种低频限制性内切酶(ApaⅠ、EcoR Ⅰ、HindⅢ和PstⅠ)和2种高频限制性内切酶(Mse Ⅰ和Taq Ⅰ)进行组合,对FAFLP预扩增和选择性扩增体系进行优化,用BioNumerics软件对分离株的指纹图谱进行聚类分析,并与VITEK 2 GN生化结果和16S rDNA序列分析进行比较.结果 Apa Ⅰ-G/Taq Ⅰ-G组合将19株椰毒假单胞菌酵米面亚种分为7个群,菌株间最低相似度为80.85％,最高相似度为98.77％.PstⅠ-T/Taq Ⅰ-G组合将19株椰毒假单胞菌酵米面亚种分为10个群,菌株间最低相似度为48.68％,最高相似度为99.67％.两种FAFLP组合均能将菌株进行完全区分,而VITEK 2 GN和16S rDNA序列分析无法将菌株进行完全区分.结论 ApaⅠ-G/Taq Ⅰ-G组合与PstⅠ-T/Taq Ⅰ-G组合FAFLP对椰毒假单胞菌酵米面亚种具有足够的分辨率,本研究建立的FAFLP分型方法可应用于椰毒假单胞菌酵米面亚种的分子分型和溯源.     

ERIC-PCR技术对单增李斯特菌的溯源分析

以质控菌株ATCC 19115为对照,采用ERIC-PCR方法对从三个市场猪肉样品分离到的17株单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)进行了基因分型,探讨了单增李斯特菌基因型与区域分布及流行性的关联性.结果表明,17株单增李斯特菌菌株可分为六个主要基因类群,其中Ⅳ型菌株最多,为主要污染类群,而这些菌株来自于市场三;市场一和市场二分离到的菌株主要分别为Ⅰ型和Ⅳ型.因此,ERIC-PCR方法适用于对单增李斯特菌的溯源分析和流行病学调查,具有简单、方便、快捷、准确的特点.     

2008—2012年上海市肠炎沙门氏菌分离株毒力基因筛查与ERIC-PCR分型

采集上海地区2008—2012年来自临床病人和市售食品的肠炎沙门氏菌分离株90株;采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,对存在于毒力岛SPI和毒力质粒上的9种常见毒力基因携带情况进行了调查;并采用本实验优化的肠杆菌基因间保守重复序列-聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR,ERIC-PCR)方法对这些分离株进行亚分型。结果显示:毒力基因inv H、sop E、sug R的携带率为100.0%(90/90),iac P、avr A、rhu M、prg K均为98.9%(89/90),而spv B、spv C分别为85.6%(77/90)和78.9%(71/90)。优化的ERIC-PCR体系能够较好地区分8种主要沙门氏菌血清型,共17株菌,辛普森指数(D值)为0.970 6。然而,90株肠炎沙门氏菌分离株却具有一致的ERIC-PCR指纹图谱。在所调查分离株中,毒力基因的携带率较高,尤其是inv H、sop E和sug R,对人类健康存在较大威胁;ERIC-PCR虽然可用于区分沙门氏菌不同血清型,但对肠炎沙门氏菌的分型效果不佳。     

温州地区蜡样芽胞杆菌分型特征研究

目的了解温州地区不同来源蜡样芽胞杆菌毒力基因分布、生化分型和多位点序列分型(MLST)特征。方法参照GB 4789.14—2014对127株蜡样芽胞杆菌进行鉴定和生化分型,同时采用PCR方法检测10种毒力基因,并进行MLST基因分型。结果 127株蜡样芽胞杆菌同时携带Nhe A、Nhe B、Nhe C基因的菌株占94.5%(120/127),而同时携带hbl A、hbl C、hbl D基因的占9.4%(12/127),携带ces基因的占7.9%(10/127);127株菌株除10株不能进行生化分型外,其余117株分为2型(0.8%,1/127)、5型(3.9%,5/127)、8型(1.6%,2/127)、9型(63.8%,81/127)和10型(22.0%,28/127);通过MLST分析,72株菌株共分为28个ST序列型,ST26(18.1%,13/72)、ST144(15.3%,11/72)、ST92(6.9%,5/72)和ST164(6.9%,5/72)为常见ST型别。28个ST型聚类分析显示温州地区蜡样芽胞杆菌分为4个序列群和13个单态群。结论温州地区蜡样芽胞杆菌毒力基因携带率较高,遗传关系具有多样性。     

ERIC-PCR和Sau-PCR对单增李斯特菌分型稳定性研究

为了研究肠杆菌间重复序列-聚合酶链式反应(ERIC-PCR)和Sau-PCR两种现代分子分型方法对单增李斯特菌(LM)分型的稳定性,取分离自广州市菜市场、超市及厦门某食品加工厂不同食品来源的5株单增李斯特菌进行实验,分别将这5株单增李斯特菌株进行室温放置培养和传代培养,提取室温放置培养24 h、48 h、和72 h及传代培养至第5代、10代、15代和20代的基因组DNA,然后同时进行ERIC-PCR和Sau-PCR分型,观察随着放置时间延长及传代次数增加其指纹图谱的变化。结果显示,5株单增李斯特菌在室温放置培养及传代培养后除部分条带发生缺失外均未出现条带增加现象,整体条带变化不大,两种分型方法的同源性分别在92%和94%以上,表明ERIC-PCR和Sau-PCR两种分型方法在室温放置培养72 h和传代培养20代内对单增李斯特菌分型相对比较稳定,具有流行病学意义。     

食品中单增李斯特菌的血清分型及脉冲场凝胶电泳分型

对进口食品和国内食品中的单增李斯特菌进行血清学分型和分子分型研究,探讨不同来源菌株之间的遗传相关性及不同分型方法之间的联系。对分离的单增李斯特菌进行血清学分型和脉冲场凝胶电泳分型。69株单增李斯特菌分为4种血清型,主要血清型为1/2a(3a)型,脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型分为55种带型,主要型别为GX6A12.CN0018。食品中的单增李斯特菌分子型别呈现多态性,进口食品分离株和国内食品分离株之间无相关性。     

食源性空肠弯曲菌的分子分型及其遗传多样性分析

为了解在2012~2014年从中国不同城市分离到的食源性空肠弯曲菌的遗传多样性特征,本研究采用多序列位点分型(multilocus sequencing typing,MLST)的方法对分离到的33株食源性空肠弯曲菌进行分子分型。研究中,对33株菌株的管家基因使用7对不同的引物进行PCR扩增,并对扩增的产物使用凝胶电泳鉴定后进行测序。将测序结果同Pub MLST中Campylobacter数据库进行比对,以获得对应菌株ST型,并提交新的ST型数据。利用其MLST数据构建进化树和最小生成树。结果显示33株食源性空肠弯曲菌可以分为27个ST型,其中有14种为新的ST型,可形成11种克隆复合体,优势克隆复合体为CC22和CC45,部分菌株的CC型也曾在临床上发现。共存在91种核苷酸多态性位点,部分等位基因之间存在重组。这表明在2012-2014年间分离得到的菌株具有丰富的遗传多样性,并且有潜在致病风险。     

乳酸杆菌脉冲场凝胶电泳分子分型的条件优化

目的:通过将脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法应用于乳酸杆菌分型研究,以建立乳酸杆菌PFGE分型的最优方法。方法:针对不同内切酶、酶切浓度、酶切时间、脉冲时间等影响PFGE分型结果的重要因素进行优化,使用优化后的条件对乳酸杆菌22株标准菌株进行分型研究。结果:在乳酸杆菌的PFGE分型研究中,选择AscI为内切酶、酶切浓度为30U/150μL、酶切时间为4.5h、脉冲时间为1～15s为PFGE电泳的最优条件,在所分析的22株乳酸杆菌标准菌株中,5种乳酸杆菌的PFGE图谱各不相同,但种内不同株电泳图谱的区别并不稳定。结论:PFGE方法可用于乳酸杆菌的基因分型研究。     

江苏地区肉鸡屠宰链弯曲菌分离菌株毒力基因分布及分子分型研究

目的了解江苏地区肉鸡屠宰生产链中弯曲菌分离菌株毒力基因分布及不同环节分离菌株遗传相关性。方法利用特异性引物对肉鸡屠宰过程不同环节分离所得的96株弯曲菌分离菌株的10种致病相关毒力基因进行聚合酶链式反应(polymera sechainre action,PCR)检测,应用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方法对分离菌株进行分子分型研究,通过与弯曲菌MLST数据库比对获得各株菌等位基因值、序列型(sequence types,STs)及克隆复合体。结果96株分离菌株中,flaA、cadF和cdtB毒力基因携带率均为100%,其次为cdtC、iam和cdtA毒力基因,携带率较高,分别为96.9%、86.5%和84.4%,另外3个毒力基因flhA、virB11、ciaB携带率均较低,分别为25.0%、15.6%、11.5%;格林-巴利综合症相关毒力基因wlaN在所有菌株中均无检出。MLST分型结果显示,96株弯曲菌可分为10个STs,其中2个为新STs,形成1种优势克隆复合体CC828(56株)和4种未定义的克隆复合体,表现为较低的遗传多样性。结论肉鸡屠宰生产链中弯曲菌毒力基因分布广泛,不同环节弯曲菌分离菌株遗传多样性较低,表明弯曲菌在肉鸡屠宰生产链中存在交叉污染。     

江西省食源性沙门菌血清分型及脉冲场凝胶电泳指纹图谱研究

研究江西省食源性沙门菌的血清型,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对优势血清型进行分子分型,建立江西省食源性沙门菌PFGE指纹图谱资料库,为食源性疾病溯源提供数据。方法 对136株食源性沙门菌进行血清分型,对其中优势血清型德尔卑沙门菌菌株进行PFGE分型,获得分子分型指纹图谱,运用Bionumerics v6.6软件进行聚类分析。结果 136株沙门菌分离株血清群以B群为主,优势血清型主要是德尔卑沙门菌(49.26%),67株德尔卑沙门菌可分为41个型别的PFGE指纹图谱(相似值100%的为同一PFGE型别),主要集中在3个型别中。结论 江西省食源性沙门菌血清型分布呈多样性,优势血清型是德尔卑沙门菌,生肉制品是其主要的来源,同种血清型别的PFGE指纹图谱无相关性。