冰糖橙皮上选育的高产曲酸菌的分离及分子鉴定

对选育的高产曲酸菌（编号Co-26）进行分离和分子鉴定。本实验采用分离高产曲酸菌株（编号Co．26）,获得纯化的菌丝体,利用真菌通用引物ITS1和IITS4扩增菌株rDNA的ITS区,扩增产物并进行测序,测序结果在GenBank中进行同源性搜索,选取部分具有代表性的ITS序列,利用软件MEGA5．1构建系统发育树,通过序列比对分析得出高产曲酸菌为米曲霉。     

湖北省烟草靶斑病病原鉴定及其菌丝融合群遗传分化研究

2020—2021年湖北烟区爆发新型烟草叶部病害,本研究对病原菌进行分离培养、形态观察、镜检菌丝和科赫法则验证,并提取30个菌株的DNA使用通用引物ITS1/ITS4进行rDNA-ITS序列的PCR扩增,及MEGA-X软件进行基因序列比对及系统发育树构建,同时以Rs1F2/Rs2R1为引物,进行30个菌株的rDNA-ITS基因的PCR专化性鉴定。结果表明,该病害病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）,30个菌株序列都隶属于R. solani AG-3融合群且均具有AG-3融合群所特有的504 bp片段。因此,确定该病害为烟草靶斑病。这是首次从湖北省烟草产区分离鉴定到该病菌。     

虫草属真菌的ITS序列分析和系统发育研究

收集不同产地虫草属真菌,进行ITS(Internal Transcribed Spacer)区段克隆测序和序列特征比较分析,并对ITS序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对,并与检索获得的7个最相似物种的ITS序列构建系统发育树.结果表明,虫草属真菌的ITS序列长度为570～576bp,GC含量56.29～56.77%,系统发育分析显示,供试菌株中除C-6与九州虫草高度同源外,其他与蛹虫草均具有高度的亲缘关系.     

高产红枣果胶酶菌株的筛选及鉴定

为从自然界寻找高效的红枣果胶酶生产菌,以红枣果胶为唯一碳源,从保定市阜平县采集的腐烂红枣、土壤等中筛选、分离纯化出一株高产果胶酶的菌株,编号为M3,该菌株在30℃摇床转速160 r/min条件下培养72 h,其果胶酶活性可达188.89 U/m L;采用CTAB法提取其基因组总DNA,利用真菌的通用引物ITS1和ITS4扩增菌株的r DNA ITS区序列,扩增产物纯化后进行测序。将测序结果在Gen Bank中进行同源性搜索,并下载部分具有代表性菌种的ITS序列,利用软件MEGA6构建系统发育树,通过序列分析,该菌株鉴定为白地霉(Galactomyces candidum)。该菌株的ITS序列基因已登录Gen Bank,登录号为:KP399955。     

云南省6种鹅膏菌DNA条形码序列分析

目的 对云南省6种鹅膏菌的核糖体大亚基(nuclear large-subunit ribosomal DNA, nLSU rDNA)及内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)DNA序列进行比对分析, 探究其亲缘关系以找到合适的鉴定鹅膏菌DNA条形码序列的方法。方法 采用试剂盒离心柱法提取6种鹅膏菌DNA, 以ITS4/ITS5作为ITS序列引物和LR5/LROR作为nLSU序列的引物进行PCR扩增, 后送至华大基因科技有限公司进行测序。所返回的序列进行遗传距离分析及邻接树构建。结果 球基鹅膏、红托鹅膏与小豹斑鹅膏3种鹅膏菌亲缘关系较近。以ITS序列分析, 三者遗传距离在0.0202~0.0801之间。以nLSU序列分析, 三者遗传距离在0.0031~0.0303之间。黄毒蝇鹅膏与赭盖鹅膏菌H2在ITS序列中与黄毒蝇鹅膏20、21、H7、D1、D16、D24亲缘关系较近, 遗传距离在0.0462~0.0479。赭盖鹅膏菌7与黄毒蝇鹅膏D14两株菌遗传距离仅有0.1528。从邻接树来看ITS序列存在种内多, 聚类分析结果不稳定, 明显不同的2个种聚为一支。而nLSU序列可将各种分离开。结论 建议鹅膏菌快速鉴定选用nLSU序列作为主要鉴定序列, ITS序列作为辅助序列。     

基于内转录间隔区序列对云南12株鹅膏菌的分子分析

目的 基于内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列对云南省12株鹅膏菌进行分类鉴定。方法 采用十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide, CTAB)法提取12株鹅膏菌DNA, 以ITS4和ITS5为引物进行PCR扩增, 完成DNA序列测序, 对序列进行分析并对发育树进行构建。 结果 12个样品的ITS序列长度574~755 bp, GC含量39%~47%, 平均遗传距离为0.329, YN05、YN03与其他10株鹅膏亲缘关系较远。结论 ITS序列高度保守, 在真菌的科属种上能够初步实现对物种的鉴定和系统 发育分析, 为建立云南省鹅膏属分子数据库提供基础数据。     

四川省鸡枞菌氨基酸组成及硒元素含量分析

采集获得四川省内10种鸡枞菌,利用全自动氨基酸分析仪测定其氨基酸组成及含量,利用原子荧光光度仪分析其硒元素含量,并利用统计学方法进行分析。结果表明：鸡枞菌子实体氨基酸含量高,总氨基酸为15.92%～28.86%,必需氨基酸含量分别为7.08%～10.20%,普通鸡枞、裂纹鸡枞、乌黑鸡枞、谷堆鸡枞、粗柄鸡枞及小鸡枞的氨基酸含量均超过20%,其中谷堆鸡枞总氨基酸及必需氨基酸分别达到28.86%、10.20%。鸡枞菌中硒含量亦较高,为长根菇的3～18倍,其中乌黑鸡枞含量达到(1.2286±0.0340)μg/g。可见四川省鸡枞菌氨基酸种类、硒含量丰富,营养价值高。     

基于ITS序列分析对疑似白羊肚菌株的分子鉴定

通过提取疑似白羊肚菌株基因组DNA,采用通用引物ITS1和ITS4扩增ITS序列,利用GenBank中的BLAST软件搜索同源序列进行比对,并构建系统发育树,对疑似菌株白羊肚进行了初步分子鉴定。结果表明,在GenBank数据库中登录的有26 个菌株与白羊肚ITS 序列相似度为99%,其中Pleurotus eryngii (杏鲍菇)15 个,P. nebrodensis(白灵菇)11 个。根据rDNA ITS 区序列分析准则和白羊肚菌褶呈网格状,菌盖为白色的形态特征,确定疑似白羊肚菌株为与白灵菇(P. nebrodensis)和杏鲍菇(P. eryngii)高度近缘的一个菌株。     

18S rDNA和ITS相结合鉴定一株盐生海芦笋内生真菌的研究

对分离自盐生海芦笋的一株代号为Salicorn 8的真菌进行鉴定,提取基因组DNA后分别PCR扩增18S rDNA和ITS区域,基因测序并进行同源性分析,构建ITS基因系统发育树,结合形态学分析,将该菌鉴定为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。     

基于DNA条形码技术鉴别有毒鹅膏菌属物种

收集27 个鹅膏菌属物种共38 份样本,提取样品基因组DNA,应用通用引物扩增其内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）、核糖体大亚基（large ribosomal subunit,LSU）、RNA聚合酶的第二大亚基（the second largest subunit of RNA polymerase II,RPB2）、β-微管蛋白（β-tubulin）基因序列并进行Sanger双向测序,将得到的序列进行校对拼接后与NCBI的GenBank数据库中的参考序列进行比对鉴别物种来源;计算物种的种内、种间Kimura-2-Parameter（K2P）遗传距离并构建系统发育树。结果表明,β-tubulin、ITS基因序列鉴别能力优于RPB2、LSU基因序列,可将β-tubulin与ITS两者联合用于鹅膏菌属的物种鉴别,为有毒蘑菇诱发的食源性中毒风险进行预警。β-tubulin基因序列长度较LSU、ITS、RPB2等基因序列短,适合对深加工的蘑菇制品以及误食毒蘑菇后的呕吐物进行分析,可作为鹅膏菌属中毒事件中物种鉴定及溯源的优选条形码。     

河豚鱼16S rRNA基因部分DNA序列分析及应用

应用16S rRNA基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增通用引物,对3 属13 种福建省搜集的河豚鱼样品与9 个未知物种的河豚鱼样品的16S rRNA基因序列中的部分片段进行PCR扩增与脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）碱基序列测定,各物种序列长度在611～614 bp之间。应用DNAMAN V6软件进行样品间DNA序列同源性比对分析,建立样品间系统关系同源树。供试13 个样品被划分为4 个类群组,群间的同源率为87%,群内同源率为94%～100%。根据序列同源性分析结果,9 个未知种名的样品被归类到3 个类群组中,推测9 个未知种名的样品为东方鲀属或腹刺鲀属。探讨了16S rRNA基因部分DNA序列测试及同源性分析技术在河豚鱼种属鉴别中应用的可能性。     

食源亚历山大藻核糖体DNA分子特征及其产毒特性的遗传差异

亚历山大藻可代谢产生麻痹性贝毒素,对人类健康和食品安全造成严重威胁。以核糖体DNA为研究对象,利用生物信息学及计算机分析软件对食源亚历山大藻核糖体DNA的分子特征进行分析,并且对亚历山大藻的产毒特性进行遗传差异研究。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增亚历山大藻核糖体18S rDNA-28S rDNA区域,利用DNAdist计算5.8S rDNA-ITS区域序列间距离值序数,同时,利用PCR-限制性片段长度多态性（restricted fragment length polymorphisms,RFLP）技术,对核糖体18S rDNA-28S rDNA进行测序分析,选择限制性内切酶MboⅡ绘制内切酶图谱。结果表明：亚历山大藻无毒株L35与产毒株在5.8S rDNA-ITS区域序列间核苷酸的差异值可达到0.201～0.488,与同属无毒亚历山大藻的核苷酸差异值＜0.004;通过酶切图谱特征条带可以准确地将不同亚历山大藻种产毒类型分3 类,酶切图谱相似的藻种产生的毒素组分相同。因此,食源亚历山大藻产毒与否以及产毒类型体现为核糖体DNA遗传信息中存在显著差异。     

烟草根结线虫生防菌限制性片断长度多态性(RFLP)分析

利用PCR-RFLP方法对烟草根结线虫生防菌单顶孢属进行了系统发育研究。以ITS₁和ITS₄为引物对该属12种14个菌株的核糖体DNA转录间区(ITS)进行了PCR扩增,4种内切酶(AluⅠ、HaeⅢ、HpaⅡ、TaqⅠ)酶切。结果表明,该属的ITS区长度没有明显差异,其长度范围在608~675之间。酶切图谱能体现不同种间的多态性,根据4种内切酶酶切结果,利用UPGMA法构建的单顶孢属分子系统树,基本体现了属内不同种间的亲缘关系,从分子水平证明了单顶孢属形态分类上的合理性      

甜瓜细菌性果斑病病原菌的分离鉴定及16S rDNA序列分析

从新疆昌吉甜瓜实验田中采集发病甜瓜样品12 份,对甜瓜细菌性果斑病病原菌进行分离纯化,并根据形态观察、致病性测定得到甜瓜细菌性果斑病病原菌1 株。以该菌总DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物进行聚合酶链式反应扩增,并克隆到pGM-T载体,测序结果表明：克隆的16S rDNA序列长度为1 493 bp,通过GenBank上序列比对搜索工具分析,并构建系统发育树,对该菌株进行鉴定,结果表明该菌属于Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems（Aac）,即燕麦嗜酸菌西瓜亚种。     

冬虫夏草与蛹虫草融合株的原生质体诱变育种

以冬虫夏草与蛹虫草融合株为研究材料,对其原生质体进行紫外诱变,筛选优质高产的新型菌株。得到了高产菌株Y-90,虫草酸产量是出发菌株的1.80 倍,高产菌株YP-42,虫草素产量是出发菌株的1.33 倍。采用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）分子标记技术和核糖体rDNA内部转录间隔区（internaltranscribed spacer,ITS）序列分析技术对突变株的遗传变异情况进行分析。结果表明突变株的ITS序列并没有发生变化。RAPD结果显示突变株的扩增片段与亲本菌株不同,说明发生了基因突变,其高产性状是可遗传的性状,可以将其用于进一步的育种研究。     

传统发酵牦牛酸乳中酵母菌的分子生物学鉴定

通过提取羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中分离到的36 株酵母菌的基因组DNA,经聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增其26S rDNA并测定序列,将序列输入GenBank中通过基本局部序列检索工具（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST）检索确定种属（同源性≥99%）。结果表明：传统发酵牦牛酸乳中酵母菌主要为马克斯克鲁维酵母17 株（47.2%）、酿酒酵母6 株（16.7%）、平常假丝酵母5 株（13.9%）、喜仙人掌毕赤酵母4 株（11.1%）、发酵毕赤酵母3 株（8.3%）,1 株鉴定失败。并构建系统发育进化树结合分子鉴定结果分析酵母菌的遗传多样性。     

基于子实体形态特征及rDNA-ITS序列分析对黔东南州枞树菌的分类鉴定

目的 为明确贵州省黔东南苗族侗族自治州(简称黔东南州)枞树菌野生菌分类地位,提供食源性野生毒蕈中毒事件中野生菌的鉴定方法依据。方法 根据枞树菌子实体特征进行形态学鉴定,基于子实体核糖体DNA内转录间隔区(rDNA-ITS)基因序列,采用邻接法(NJ)进行系统发育关系分析。结果 黔东南主要贸易乳菇属类的枞树菌有3种,根据子实体形态特征将靛蓝色、紫红色、橙黄色样本分别鉴定为靛蓝乳菇亚种(Lactarius subindigo)、红汁乳菇(Lactarius hatsudake)和鲜艳乳菇(Lactarius vividus)。从GENBANK下载31个菌株与3个代表样本ITS基因序列构建的系统发育树分为两大分支,枞树菌与其他近缘红菇属有毒菌类明显区分;代表样本TL1与靛蓝乳菇亚种、TZ1与红汁乳菇、TH1与鲜艳乳菇分别聚为一簇,与形态学鉴定结果一致。结论 黔东南地区枞树菌主要贸易种为红汁乳菇和鲜艳乳菇,与贵阳地区的紫花菌属同物异名,其中靛蓝乳菇亚种属贵州省首次报道。     

Evaluation of gene index for identification of Byssochlamys spp

Comparative sequence analysis was performed on the 18S rRNA gene (1,676 bp), 26/28S rRNA gene D2 region (321 bp) and lys2 (997 bp) to evaluate the gene index for rapid, accurate and convenient identification of Byssochlamys spp. and related species. The results showed that 26 strains (11 species) of the clade could be identified or grouped by means of each gene sequence. The highest resolution to discriminate these species was observed with lys2, but 26/28S rRNA gene D2 region was considered to be the best index for convenient identification. In addition, phylogenetic analysis based on these genes indicated that genus Byssochlamys is not monophyletic, although species in the clade are closely related to each other. Re-classification will be necessary, based on detailed morphological observations.     

海芦笋内生真菌基于PKS Ⅰ型功能基因的分离与鉴定

以采自新疆盐湖的野生海芦笋为研究对象,以聚酮合成酶（polyketide synthase,PKS）Ⅰ型功能基因为指标,采用平板划线技术、斜面分离纯化技术分离内生真菌,从中筛选出1 株含有PKS Ⅰ型基因、编号为Salix 1的内生真菌,进而PCR扩增该菌的18S rDNA和ITS1-5.8S-ITS2 rDNA目标序列,在美国国立生物技术信息中心（NationalCenter of Biotechnology Information,NCBI）上进行同源性分析,构建系统发育树,结合形态学观察,将菌株Salix1鉴定为杂色曲霉。     

利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脱氢酶基因及其生物信息学分析

以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板,基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物,通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase,GDH）的全长基因（gdh）,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：gdh基因全长2 268 bp,编码755个氨基酸,其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的分子质量约为81.72 ku,pI值约为5.14;GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成;GDH N末端的AA 1～140区域有5个跨膜结构域。