产酱香风味芽孢杆菌类菌株发酵代谢产物及其酶分析研究

酱香白酒生产过程中的制曲、堆积等工艺环节可富集大量芽孢杆菌,这些芽孢杆菌是酱香风味成分形成的基础和关键.对从酱香型白酒生产制曲、堆积酒醅和发酵期酒醅中分离的地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌3类芽孢杆菌的分离、鉴定、产香、产酶等进行总结,详述了3类产香芽孢杆菌发酵代谢产香的特征性成分、特征性酶、产香过程风味的特征性变化和群体微生物发酵机制.     

酱香型酒醅产香芽孢杆菌的分离鉴定及其代谢产物分析

本文研究了酱香型酒醅中的产香芽孢杆菌及其优势代谢产物。通过平板分离法从酱香型酒醅中筛选出5株芽孢杆菌,采用PLFA技术对其鉴定,分别为:蜡样芽孢杆菌(Bacillus ereus)、泛酸枝芽孢杆菌(Virgibacillus pantothenticus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);革兰氏染色试验结果说明:这五类菌株均为革兰氏阳性菌;生化分析发现:枯草芽孢杆菌产淀粉酶能力最强,巨大芽孢杆菌蛋白质水解能力最强;以高粱粉为底物进行固态发酵,采用GC-MS分析技术对发酵代谢产物进行分析表明:菌株的优势产物主要为3-羟基-2-丁酮,另外还有少量的2,3-丁二醇和酯类等芳香物质。蜡样芽孢杆菌、泛酸枝芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌这五类菌株是酱香型白酒主要的产香功能菌。     

陶融型大曲中产香微生物的筛选及鉴定

本研究从陶融型大曲微生物资源中筛选产香功能性微生物,研究其与大曲香味物质之间的联系,并对产香功能菌株进行分子生物学鉴定。采用传统微生物分离法从不同发酵阶段的陶融型大曲中分离纯化获得细菌37株,酵母22株。以小麦固体培养基为底物对各菌株进行单菌产香实验,经闻香评定,菌株YSY04发酵后能产生浓郁的香味。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对这该菌株的发酵产物进行挥发性成分检测,发现该菌株的发酵产物中香味物质种类丰富,其中吡嗪类物质、苯乙醇、愈创木酚、2,3-丁二醇和萜烯类等香味物质为陶融型大曲的重要香味成分。因此,可初步认定菌株YSY04为陶融型大曲的产香功能菌。经形态学观察和分子生物学鉴定,菌株YSY04为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。     

高产酯菌株的筛选及其在酱香型白酒堆积发酵中的应用

采用传统培养分离法从酱香型白酒堆积酒醅中分离筛选发酵性能优良的菌株,通过形态观察及分子生物学技术对其进行鉴定,并对其耐受性进行研究,最后将其应用于酱香型白酒堆积发酵,探究其对酒醅风味物质和微生物菌群结构的影响。结果表明,分离筛选得到1株发酵性能优良的菌株,编号为GTY-837,经鉴定其为东方伊萨酵母菌（Issatchenkia orientalis）,该菌株可以耐受乙醇体积分数10%、乙酸0.5%、乳酸4.0%,且在40 ℃高温下仍能生长。使用菌株GTY-837进行堆积培菌实验,与空白相比,当接种量为3%时酒醅中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量分别提高4 059.45%和70.99%,同时酒醅中其他酯类、芳香族和呋喃类等风味物质的含量也显著增加,但四甲基吡嗪（TTMP）含量降低,可能是菌株GTY-837抑制了酒醅芽孢杆菌属（Bacillus）的生长所致。     

浓香型白酒酒醅中乳酸菌分离及其对模拟固态发酵的影响

从发酵酒醅中分离得到21株产乳酸菌株,其中16株为芽孢杆菌。利用梅里埃微生物鉴定仪鉴定,得到干燥棒杆菌（Corynebacterium xerosis）、耳葡萄球菌（Staphylococcus auricularis）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、腊状芽孢杆菌（Bacillus cereus group）、浸麻芽孢杆菌（Paenibacillusmacerans）6种产乳酸菌。将6株产酸菌进行模拟固态发酵,结果显示所有乳酸菌都不同程度的抑制了己酸、己酸乙酯以及乳酸乙酯的产量,其中浸麻芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌属的2株产乳酸菌严重抑制了乙醇和己酸乙酯的生成量,巨大芽孢杆菌的一株还严重抑制了己酸的产量。     

平坝窖酒生产中芽孢杆菌对酒体风格的影响

从平坝窖酒偏高温大曲及发酵酒醅中分离筛选获得产香芽孢杆菌9株,利用产香芽孢杆菌制成纯种麸曲,按不同方案应用于酿酒生产。结果表明,用产香芽孢杆菌制曲并用于酿酒均有助于平坝窖酒酒体风格特征的形成和增加酒的酱香风味。     

洋河浓香型白酒酒醅中产酸细菌与有机酸合成的相关性研究

从洋河浓香型白酒酒醅中分离得到了产乙酸(醋杆菌)和乳酸(乳酸菌及芽孢杆菌)的分属于6个菌属的12株细菌,其中植物乳杆菌JP3和巴氏醋杆菌JP10分别是产乳酸和乙酸能力最强的菌株。温度、乙醇含量和培养基初始p H值对醋杆菌产乙酸能力均有影响,对乳酸菌和芽孢杆菌产乳酸能力影响较大的因素是培养基初始p H值。通过监控窖内发酵过程发现,乳杆菌和芽孢杆菌是酒醅中数量最多的细菌,窖内发酵前期魏斯氏菌和醋杆菌的数量显著高于发酵中后期,酒醅中乳球菌和足球菌的数量在窖内发酵过程变化相对较小。Pearson相关性分析结果表明,乙酸的合成与多种微生物相关,且发酵0～15 d与醋杆菌相关性最好;乳酸的合成在发酵0～15 d与多种微生物相关,发酵15～60 d仅与乳杆菌显著正相关。该研究分析了浓香型白酒发酵不同阶段微生物与乳酸、乙酸合成的关系,为提升白酒品质提供了理论依据。     

沉香型酒醅中产香芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析

从沉香型酒醅中分离产香芽孢杆菌并进行发酵风味分析。通过平板分离得到4株产香较好的芽孢杆菌,并进行16S rDNA序列分析和构建系统发育树,4株菌分别为阿式芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniform）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。其中地衣芽孢杆菌产蛋白酶和淀粉酶能力均为最强且最适生长温度为50 ℃。以玉米粉为底物进行单菌液态发酵,采用固相萃取和气相色谱-质谱法(SPME-GC-MS)分析发酵液中的风味物质,一共检测到24种风味物质,其优势产物主要为3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇和一些酸类等风味物质。由此而见,阿式芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌这4类菌对沉香型白酒风味的形成均具有重要作用。     

酱香型白酒酿造酒醅中产香芽孢杆菌的分离鉴定

为了改善并增强酱香型白酒香气,使其具有独特的风味特征,本研究从七轮次混合酒醅中分离到的7株菌中筛选到一株产香性能较优的菌株DAI bj-1。通过观察该菌株在肉汤琼脂培养基上的菌落形态及细胞形态特征（革兰氏染色为阳性）,初步判断该菌为革兰氏阳性菌。通过革兰氏阳性菌鉴定卡（GP）、芽孢菌鉴定卡（BCL）等生理生化实验结果,PCR扩增、上机测序以及系统发育树的构建分析,该菌株与标准菌株序列的相似性为99.93%,即酒醅中分离筛选到的菌株DAI bj-1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。     

陶香型窖池中1株高产乙酸乙酯酵母的筛选与鉴定

从仰韶陶香型窖池糟醅中筛选产香功能微生物,研究其与大曲酒香味物质之间的联系,并对产香功能菌进行分子生物学鉴定。采用传统微生物分离方法,从不同发酵阶段的陶香型窖池糟醅中分离获得25株酵母菌。以豆芽汁培养基为底物,对各酵母菌株进行单菌产香实验,经闻香评定,菌株YS/Y/22能够产生浓郁的酒香味和水果香味。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对该菌株的发酵产物进行挥发性成分检测分析,发现菌株YS/Y/22发酵产物的主要香味成分为乙酸乙酯,是大曲酒的重要香味成分之一,因此可确定菌种YS/Y/22为陶香型窖池糟醅中的1株产香功能菌。经形态学观察和分子生物学鉴定,确定菌株YS/Y/22为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。     

发酵肉用凝结芽孢杆菌的筛选及其发酵特性

通过测定菌株的发酵特性进行初筛和复筛,最终筛选得到1 株能耐受5 g/100 mL NaCl和150 mg/kg NaNO2、抑菌特性优良、发酵酶系丰富的菌株L-H7,经形态特征、生理生化、16S rDNA鉴定为凝结芽孢杆菌。 模拟发酵香肠实验结果显示,采用凝结芽孢杆菌L-H7、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌复配发酵制备的香肠在发酵期 间具有良好的产香气特性,其挥发性风味物质中含有1-辛烯-3-醇、癸酸乙酯、壬醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛等特有 的香气物质,说明凝结芽孢杆菌L-H7具有作为发酵香肠功能性发酵剂的潜力。     

酒醅中产纤溶酶细菌的分离及发酵产酶研究

该研究从酒醅中筛选高产纤溶酶的细菌。经过初筛和复筛得到1株高产纤溶酶的菌株,命名为DL-1。通过菌株形态学和生理生化试验初步鉴定菌株DL-1为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。菌株DL-1产纤溶酶发酵试验结果表明,最适菌龄为4 h,最适碳源为牛肉膏,最适氮源为豆饼粉。在此条件下,所产的纤溶酶在血纤维蛋白平板上形成的溶圈面积可达379.79 mm2。     

含香兰素冬虫夏草发酵液的制备工艺研究

该研究采用传统培养分离法从大曲、酒醅等原料中分离筛选能以葡萄糖为底物产香兰素的芽孢杆菌,并通过分子生物学技术对其进行鉴定。利用该菌株发酵冬虫夏草,并以香兰素含量为评价指标,采用单因素试验及响应面试验对其发酵工艺进行优化。结果表明,分离筛选得到一株香兰素产量较高的菌株B4-9,经鉴定,为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,其发酵冬虫夏草的最佳工艺参数为料液比1∶30、装液量20%、pH 7、接种量10%、培养温度43 ℃、摇床转速200 r/min,发酵时间9 d,在此条件下,冬虫夏草发酵液中香兰素含量可达到4.6 mg/L。     

Streptomyces sp. A22对酱香白酒酿造风味调控的研究

应用从酱香型白酒发酵过程中分离获得的一株产土臭味放线菌（Actinomycetes sp.）A22与产酱香解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B6进行模拟固态发酵,研究其对发酵过程主要特征风味化合物形成的影响及其调控。结果表明,放线菌Streptomyces sp. A22可导致解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）B6代谢富集吡嗪类化合物总量降低,对其代谢吡嗪具有调控作用;而B. amyloliquefaciens B6抑制Streptomyces sp. A22代谢富集土臭素,降低发酵糟醅中的异味;Streptomyces sp. A22与B. amyloliquefaciens B6之间存在相互的生物学调节关系,混菌发酵过程可相互抑制其生物量,这是导致其发酵过程风味调控的根本机制,影响酒体中酸类、醇类、酯类等风味物质的形成,改善酒体风味。     

酱香型白酒窖醅中耐高温产香酵母的筛选及性能研究

探讨白首乌酒对癫痫大鼠神经元保护作用及其机制。50只SD大鼠随机分为空白组、模型组、白首乌酒提取物（CBLE）低剂量组（4 mL/kg）、高剂量组（10 mL/kg）。除空白组外其他组大鼠进行癫痫模型的建立,建模成功后进行Racine评分、记录癫痫发作次数及首次癫痫发作持续时间;通过苏木精-伊红（HE）染色法、切片扫描,观察大鼠神经元损伤情况;蛋白免疫印迹（Western bolt）分析大鼠大脑海马组织中p38MAPK蛋白表达量。结果表明,CBLE各剂量组Racine评分、癫痫发作次数和首次癫痫发作持续时间与模型组相比显著降低（P＜0.05）、海马神经细胞紧密性有明显提高;CBLE各剂量组p38MAPK/GADPH比值与模型组相比都有差异性（P＜0.05）。结果表明,高剂量的CBLE可以减轻癫痫症状,对癫痫大鼠神经元具有保护作用,这种保护作用是通过抑制p38MAPK蛋白的表达实现的。     

浓香型大曲中功能性酵母菌的筛选、鉴定及发酵特性研究

以浓香型大曲为研究对象,采用稀释涂布平板法从中分离酵母菌,对其形态特征进行观察;采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）显色法初筛,通过发酵力、产酒能力、耐高温、耐酒精能力实验进行复筛,筛选一株优良的功能性酵母菌,利用Biolog微生物自动分析系统对其进行鉴定,并利用顶空固相微萃取气质联用（HS-SPME-GC-MS）法对其液态发酵产物进行分析。结果表明,从浓香型大曲中共分离出9株酵母菌,其中菌株NDY-06性能最突出,可耐受42 ℃的高温,16%vol的酒精度,且具有一定的发酵产酒能力;该菌株被鉴定为产香酵母Zygosaccharomyces cidri,从其液态发酵产物中共检测到35种挥发性风味物质,包括醇类物质7种,酯类物质13种,酸类物质7种,吡嗪类物质3种,对白酒香气成分有一定的贡献。     

宜宾产区浓香型白酒酿造生境中细菌的群落结构

该文利用高通量测序技术全面解析宜宾产区浓香型白酒酿造生境中的微生物菌群结构,并对窖泥、大曲、酒醅和黄水中的细菌种类和丰度进行对比分析。结果表明,从宜宾产区白酒酿造生境的26个样品中共注释到来自于201个属的1493个OTUs,主要分布于拟杆菌门(Bacteroidete)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),其中5个属来自于古菌域的广古菌门(Euryarchaeota)。窖泥样品中微生物菌种的多样性最高,主要以古菌、瘤胃球菌和乳酸菌为主;大曲的多样性次之,主要包括未鉴定到属水平的细菌,芽胞杆菌、乳酸菌和高温放线菌等;酒醅和黄水中的微生物多样性最低,其主要微生物类群以乳酸菌和瘤胃球菌为主。宜宾产区浓香型白酒酿造过程微生物群落结构呈现出从多种微生物共同作用到功能微生物主要发挥作用的趋势。该研究为探究浓香型白酒酿造过程中功能微生物,解析白酒酿造机理,提升白酒品质奠定了基础。     

高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的筛选及其对酱香型白酒堆积过程的影响

为提高和稳定白酒中四甲基吡嗪含量,本研究从酱香大曲样品中分离出13株芽孢杆菌,通过蛋白酶透明圈试验初筛,选出5株产蛋白酶优良菌株。经过液态发酵试验筛选出一株高产四甲基吡嗪的功能菌,其发酵液中的四甲基吡嗪含量为12.22 mg/L,鉴定为地衣芽孢杆菌GTBL-168。将该菌株的种子培养液按0%、3%、5%和7%（v/w）接种到酱香型白酒堆积培养中与传统大曲协同发酵,堆积糟醅中乙偶姻和四甲基吡嗪的含量均有提高,其中接种量为7%时增量最大,四甲基吡嗪产量比对照组提高24.88%;理化指标总体变化较明显,氨基氮和总酸有所增加;地衣芽孢杆菌GTBL-168的添加对堆积糟醅的菌群结构影响不大,随着接种量的增加糟醅中芽孢杆菌属等各优势菌属丰度也随之增加。为功能菌在堆积过程中的应用研究奠定了基础。     

清香型白酒酒醅发酵菌株分离鉴定及细菌群落结构分析

采用纯培养技术对清香型白酒酒醅中的乳酸菌和芽孢杆菌进行分离鉴定,同时通过Illumina MiSeq高通量测序技术解析清香型白酒酒醅细菌群落结构。结果表明,所有酒醅样品共分离得到13株乳酸菌,分别鉴定为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）4株、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）3株、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）3株、粪肠球菌（Enterococcus faecium）2株以及希尔氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）1株。从酒醅中分离得到的17株芽孢杆菌菌株分别鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）9株、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）2株、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）2株、澳洲芽孢杆菌（Bacillus australimaris）2株、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）1株以及蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）1株。Illumina MiSeq高通量测序技术结果显示,酒醅中优势菌门分别为厚壁菌门（Firmicutes）（97.96%）、放线菌门（Actinobacteria）（1.24%）和变形菌门（Proteobacteria）（0.76%）;优势细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）（97.42%）、栖热嗜油菌属（Thermoleophilum）（1.22%）和假单胞菌属（Pseudomonas）（0.72%）。