Bacillus mucilaginosus荚膜多糖脱除与

为了建立胶质芽孢杆菌全蛋白的双向电泳技术体系,分别比较了荚膜多糖去除方法,不同菌体蛋白提取方法,不同类型IPG胶条以及不同等电聚焦程序对双向电泳图谱的影响。结果表明,预先使用低浓度的盐酸多次处理能够完全去除荚膜多糖,然后采用TCA-丙酮与酚抽提结合法提取胶质芽孢杆菌全蛋白的效果最佳。采用17 cm pH 4～7的线性IPG胶条,在程序Ⅱ下获得了背景清晰,分辨率较高,且无明显横纵条纹的胶质芽孢杆菌全蛋白双向电泳图谱。采用以上条件,所得图谱约分离得到700个蛋白质点,该双向电泳图谱的构建为胶质芽孢杆菌双向电泳研究奠定了基础。     

蕨菜总蛋白质双向电泳技术体系的建立

为了建立蕨菜中总蛋白质的双向电泳技术体系,作者以新鲜蕨菜为实验材料,分别比较了不同蛋白提取方法,不同上样量以及不同pH范围IPG胶条对2-DE图谱的影响。结果表明,采用TCA-丙酮结合酚抽法提取蕨菜中的蛋白质,采用IPG胶条pH5-8、蛋白质的上样量为1 200μg、考马斯亮蓝G-250胶体考染法进行染色。在此条件下进行蕨菜全蛋白质的双向电泳所得到的图谱蛋白质点多达719个,且蛋白质点分布均匀、背景清晰、分辨率较高。     

地衣芽孢杆菌总蛋白双向电泳方法的建立和优化

探索建立有效的地衣芽孢杆菌蛋白质组双向电泳体系,为进一步揭示地衣芽孢杆菌促进氧化葡萄糖酸杆菌产酸的作用机制奠定基础.以地衣芽孢杆菌为材料,比较蛋白质制备超声破壁时间、新型细胞裂解液、pH梯度和不同上样量对地衣芽孢杆菌蛋白双向电泳结果的影响.结果显示:采用15min超声破壁提取地衣芽孢杆菌总蛋白,选用新型蛋白质裂解,用长24cm、pH4～7的IPG胶条,在上样量为80μg进行等电聚焦,于60V 15min、120V 6h条件下进行SDS-PAGE垂直电泳,可以获得背景清晰、重复性好的双向电泳图谱.在探索出一种新型可行的新型细胞裂解液的同时,建立一套用于地衣芽孢杆菌蛋白质组分析的双向电泳方法.     

华根霉细胞总蛋白及膜蛋白双向电泳优化体系的建立

分别针对丝状真菌华根霉细胞总蛋白和膜蛋白,比较了不同蛋白样品的提取方法及IPG胶条的p H梯度对2-DE结果的影响,获得了较优的双向电泳图谱,通过重复实验及蛋白点匹配分析,确定了不同方法的适用性。分别采用Ready PrepTMProtein Extraction Kit试剂盒和Triton X-100提取细胞总蛋白和膜蛋白,利用p H 3~10非线性IPG胶条,可获得相应蛋白点数较多、分辨度高、较清晰、重复性好的华根霉细胞总蛋白和膜蛋白2-DE图谱。利用PDQuest 8.0.1软件分析,细胞总蛋白重复样品间和膜蛋白重复样品间的蛋白斑点匹配度分别达到87%和94%。该研究为华根霉及其他相关微生物蛋白质组学研究奠定了技术基础。     

阪崎克罗诺杆菌全菌蛋白质双向电泳技术和图谱的建立

建立阪崎克罗诺杆菌全菌蛋白双向电泳技术。采用2种不同的尿素-3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)-二硫苏糖醇(DTT)裂解法兼反复冻融提取阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544全菌蛋白,在2种pH范围的固相pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳,胶体考染后获得的双向电泳图谱进行Image Master 2DPlatinum软件分析。结果表明,获得全菌的蛋白浓度为5.32μg/μL;裂解液成分:尿素7 mol/L,硫脲2 mol/L,CHAPS 4%(m/V),DTT 1%(m/V),PMSF 45mg/L,pH 3～10IPG缓冲液2%(V/V)。该技术成功构建了阪崎克罗诺杆菌全菌蛋白质双向电泳图谱。     

凡纳滨对虾肌肉蛋白质双向电泳分离技术的建立及优化

建立凡纳滨对虾肌肉组织双向电泳分离技术并对其进行优化。通过液氮研磨和液氮研磨+超声破碎的方式提取对虾肌肉组织蛋白质。采用7 cm的IPG胶条进行双向电泳,凝胶染色后进行图谱分析,并对裂解液配方、胶条p H值、蛋白质上样量、凝胶染色进行优化。结果显示,以液氮研磨+超声破碎,裂解液Ⅱ提取对虾肌肉蛋白质;采用p H 4~7 IPG胶条,180μg蛋白质上样量,并用考马斯亮蓝G-250胶体考染(蓝银)染色,成功得到背景清晰,分辨率较高的凡纳滨对虾肌肉蛋白质双向电泳图谱,这为凡纳滨对虾肌肉蛋白质组学分析及肌肉品质变化的分子标记识别提供基础。     

油茶种仁总蛋白提取及双向电泳分析

以油茶种仁为实验材料,用不同方法提取油茶种仁总蛋白,同时对双向电泳条件进行了探索与优化,建立了一套适合油茶种仁总蛋白双向电泳分析的优化体系。结果表明:改良后的TCA-丙酮法可以有效提取出油茶种仁总蛋白,得到了816个蛋白点,蛋白点主要集中在等电点p H 4.0~6.0之间;选用17 cm p H 4~7 IPG胶条,优化的等电聚焦程序为250 V 0.5 h、1 000 V 2 h、8 000 V5 h、8 000 V 60 000 Vh和500 V 24 h,可获得背景清晰、分辨率较高的双向电泳图谱。     

甜椒果实总蛋白质双向电泳优化体系的建立

以甜椒果实"红方"为实验材料,对其果实总蛋白制备方法、蛋白提取液的pH、总蛋白的上样量、IPG胶条的pH范围及等电聚焦程序进行条件优化,建立了适用于甜椒果实总蛋白分析的双向电泳体系。结果表明,采用提取液为pH7.8的酚提法制备的甜椒果实总蛋白、17cm pH5~8的IPG胶条、上样1200μg进行66000VH等电聚焦和垂直凝胶电泳,经过考马斯亮蓝G-250胶体考染后得到可用于进一步质谱分析的电泳图谱,图谱的蛋白点分布均匀、背景清晰、分辨率高。经统计,其总蛋白点达到703±17个。     

桃果实总蛋白质双向电泳优化体系的建立

以"晖雨露"水蜜桃为试验材料,建立了一种适用于桃果实总蛋白质的双向电泳体系。最终试验确定采用酚抽法提取桃果实蛋白质,采用17 cm,pH 4~7的线性IPG胶条,800μg蛋白质上样,并用考马斯亮蓝G-250胶体考染,可以得到背景清晰、分辨率高的双向电泳图谱。对影响双向电泳图谱质量的因素进行了讨论分析。     

肉类耐热蛋白提取及双向电泳条件优化

物种定量鉴别检测技术,已成为肉类真伪鉴别研究的热点。现有常用的实时荧光PCR法在定量检测方面存在方法缺陷。而基于蛋白质的ELISA检测方法,具有抗干扰能力强、快速、对仪器要求低的优点,已越来越多应用于食品中特征蛋白的定量检测。肉制品加工工艺中,热处理是蛋白质变性的主要原因,因此应选择热稳定特征蛋白,而建立常见肉类热稳定蛋白质双向电泳图谱是选择热稳定特征蛋白的基础。然而双向电泳是一个复杂的过程,想获得良好的电泳图谱并找到特征蛋白点需要多方面进行优化。从蛋白质提取纯化方法、IPG胶条长度、p H范围、上样量选择方面对其进行优化,最终获得稳定的、能够找到特征蛋白点的双向电泳图谱。     

高白鲑肌肉蛋白质组双向电泳技术体系的优化

为建立高白鲑肌肉蛋白质双向电泳分析方法,通过固相p H梯度胶条等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳对蛋白质进行分离,分别考察了蛋白质样品制备方法、上样量、IPG胶条p H值、等电聚焦程序、助凝剂剂量、SDS-PAGE凝胶浓度及染色方法等影响的因素。结果显示,采用丙酮沉淀法制备蛋白质样品,上样量90μg,IPG胶条pH值5～8,一向胶聚焦时间400 V 16 h+1 000 V 2 h,平衡时间15 min,0.05 m L过硫酸铵及2μL TEMED,10%(体积分数)二向分离胶和硝酸银染色时,获得蛋白质分离效果好,分辨率高及横纹少的高白鲑肌肉蛋白质二维电泳图谱,为高白鲑肌肉蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。     

油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

以显性核不育油菜Shaan—GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料,采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白,对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明,采用理想的蛋白质裂解液（7mol／L尿素,2mol／L硫脲,4％CHAPS（3-[3-（胆酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐）,65mmol二硫苏糖醇,0．5％IPG缓冲液pH3～10或pH4～7,全蛋白酶抑制片剂（片／10mL））裂解蛋白,以150μg上样,按IEF程序Ⅱ（30V,12h;200V,1h;500V,1h;1000V,0．5h;10000V,2h;10000V,8h）进行等电聚焦,10％SDS—PAGE胶浓度进行第二向电泳,银染方法检测,可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。     

华根霉蛋白质组双向电泳体系的建立及优化

华根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M201021)是从我国传统微生物载体——大曲中分离筛选得到的一株丝状真菌,具有重要的工业应用前景。为建立一种适于华根霉胞内蛋白质的双电泳体系以进行蛋白质组学研究,作者对华根霉胞内蛋白质的提取方法及双向电泳流程相关参数进行了考察和优化.确定采用液氮研磨与高速珠磨相结合的方法对华根霉进行细胞破碎,用TCA/丙酮对提取的蛋白质进行纯化,采用被动水化的上样方式上样,24 cm、pH 4～7的线性IPG胶条,上样量为1 200 μg蛋白质,考马斯亮蓝G-250股体染色法,最终得到了背景清晰、分辨率高的双向电泳图谱。     

烟草叶片蛋白质组双向电泳实验体系的建立

选用干旱敏感型栽培烟草品种中烟100旺长后期的叶片和感黑胫病栽培烟草品种小黄金1025苗期的叶片作为实验材料,总蛋白质提取分别采用稍加改进的TCA/丙酮法和由蛋白质分级提取、酚抽提及丙酮洗涤相结合的方法。对中烟100旺长后期烟草叶片采用的总蛋白质TCA/丙酮提取方法进行了优化、对其使用的IPG胶条pH范围做了初步筛选,并在此研究基础上,对采用第二种提取方法获得的小黄金1025苗期烟草叶片总蛋白质样品进行了不同上样量对双向电泳结果影响的比较实验。初步建立起适合烟草叶片蛋白质组研究的双向电泳实验体系。     

基于荧光标记的大黄鱼氧化肌肉蛋白质双向电泳技术的建立

在确定大黄鱼肌肉蛋白质双向电泳分离的基础上,采用荧光素-5-氨基硫脲(fluorescein-5-thiosemicarbazide,FTSC)对氧化的大黄鱼肌肉蛋白质进行荧光标记和参数优化,进而建立氧化肌肉蛋白质的双向电泳技术体系。结果显示,氧化肌肉蛋白质较佳的双向电泳程序为:蛋白样品采用液氮研磨和裂解液Ⅲ(含8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%3-(3-(胆酰胺丙基)二甲氨基)丙磺酸内盐(CHAPS)、65 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)和0.2%载体两性电解质)制备;采用FTSC溶液40℃恒温水浴3 h,对氧化蛋白质进行荧光标记,并采用乙醇-乙酸乙酯混合溶液进行洗脱;标记后的蛋白样品采用p H 5~8的固定化p H梯度(IPG)预制胶条上样后,采用等电聚焦程序C(50 V主动水化14 h,500 V、2 h,1 000 V、1.5 h及4 000 V、1 h三段式除盐,6 000 V、0.5 h和10 000 V、1 h两段式升压,10 000 V聚焦80 000 vhr,最后500 V保持10 h)进行第1向分离,再采用12%的聚丙烯酰胺分离胶进行第2向分离;最后所得凝胶经直接荧光扫描和银染后扫描分别得到氧化肌肉蛋白质的荧光图谱和肌肉全蛋白电泳图谱。由该程序获得的双向电泳图谱具有分离度好、蛋白点清晰、分布均匀等优点,为利用双向电泳和蛋白质组学技术分离鉴定氧化蛋白质种类、进而阐明蛋白质氧化机制提供理论依据。     

酿酒酵母蛋白质双向电泳条件优化及图谱建立

利用双向电泳技术分离酿酒酵母全蛋白质,并比较了不同样品制备方法、不同凝胶参数,以及不同染色方法对电泳结果的影响。经过各个环节的条件优化,最终获得了无明显横纵条纹,背景清晰,分辨率较高,重复性较好的酿酒酵母全蛋白质双向电泳图谱。经PD-Quest软件分析,所得图谱约分离到1 000个蛋白质点,该双向电泳图谱的构建为后续氮代谢研究奠定了基础。     

韭菜籽蛋白对枯草芽孢杆菌的抑菌实验研究

目的:为了研究韭菜籽蛋白对枯草芽孢杆菌的抑菌作用;方法:采用滤纸片法研究了经过不同温度、加热处理时间和p H值处理的韭菜籽蛋白对枯草芽孢杆菌的抑制作用,并利用响应面法优化了韭菜籽蛋白的处理条件,建立响应曲面模型,并采用Design Expert程序分析;结果:确定了韭菜籽蛋白抑制枯草芽孢杆菌的最适处理条件,即韭菜籽蛋白在p H8.05,温度在41.25℃下处理3.92 h,抑菌效果最佳;结论:韭菜籽蛋白对枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用。     

不同细胞破碎方法对肉牛、牦牛背最长肌双向电泳图谱的影响

采用液氮研磨、液氮研磨辅助超声波破碎和液氮研磨辅助玻璃珠破碎3种细胞破碎方法对肉牛、牦牛背最长肌蛋白质提取和双向电泳图谱效果的最佳方法进行研究。在相同裂解液组成、等电聚焦程序、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)操作、银染法染色等双向电泳条件的处理下,通过Bradford法分别测定不同方法提取的肉牛和牦牛肉背最长肌中蛋白质的含量,并采用PDQuest 8.0.1软件对双向电泳图谱的效果进行分析。结果表明:3种细胞破碎方法提取的肉牛和牦牛背最长肌蛋白质含量差异显著,其中液氮研磨辅助超声波破碎法((2.59±0.15)、(2.84±0.29)μg/μL)显著高于其他2种方法,液氮研磨辅助玻璃珠破碎法((2.01±0.04)、(2.21±0.02)μg/μL)显著高于液氮研磨法((1.77±0.11)、(1.95±0.19)μg/μL)。3种方法所得肉牛背最长肌双向电泳图谱的蛋白点个数分别为(279±19)、(581±15)、(363±21)个;所得牦牛肉双向电泳图谱的蛋白点个数分别为(292±15)、(596±12)、(385±17)个。3种方法中液氮研磨辅助超声波破碎法提取的肉牛、牦牛背最长肌蛋白质含量最高,数量最多,蛋白点分离程度最好,并且3种细胞破碎方法在牦牛背最长肌中提取的蛋白质含量与肉牛背最长肌中提取的蛋白质含量差异不显著。     

黄酒麦曲浸提液中宏蛋白质组的制备

麦曲在黄酒酿造中具有重要作用,它能为黄酒酿造提供各种酶类(如水解酶等)及各种风味物质前体。该研究基于宏蛋白质组学理论,分别采用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-D Cleanup Kit试剂盒法提取了黄酒麦曲浸提液中的宏蛋白质组,比较了采用3种不同方法制备样品的双向电泳结果。研究发现,用2-D Cleanup Kit试剂盒制备的样品在溶解性、蛋白纯度和双向电泳分离效果等方面都优于另外2种方法,图谱分辨率高,蛋白点清晰。初步建立了适用于黄酒麦曲浸提液的宏蛋白质组制备方法,获得了较为理想的双向电泳图谱,为后续利用质谱分析手段对宏蛋白质组中的蛋白组成进行全面、准确鉴定奠定了基础。     

大麦和麦芽水溶性蛋白提取方案的优化及双向电泳图谱的建立

为了建立一套适用于大麦和麦芽的双向电泳分析方法,得到更加清晰、全面的双向电泳图谱。以高产优质大麦品种Gairdner为材料,对提取方法以及提取过程中所用的试剂的种类、用量和处理时间等进行比较分析和优化,运用蛋白定量法测定提取样品的蛋白质含量,摸索出一套完整的用于双向电泳分析的大麦蛋白提取和样品制备方法。大麦或麦芽经研磨,缓冲液-苯酚提取,醇洗,冻干后得到的蛋白质样品,双向电泳分离,硝酸银染色,PDQuest分析,图谱结果显示大麦检测到700个蛋白质点,麦芽检测到500个蛋白质点。这一方法的构建可作为大麦蛋白质组研究的重要工具,为今后大麦蛋白质组学以及对大麦品质改良的研究奠定了一定的基础。