2012—2015年北京市西城区单核细胞增生李斯特菌多位点序列分型及耐药研究

探讨单核细胞增生李斯特菌多位点序列分型(MLST)与耐药性的关联性,确定某些具有高致病性潜能的流行克隆株的存在。方法 采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法和E-test药敏试条法对14种抗生素进行药物敏感性试验,以MLST技术对50株菌株进行基因分型。结果 单核细胞增生李斯特菌耐药率为22.00%(11/50),并出现多重耐药株。50株单核细胞增生李斯特菌MLST分析共获得12个型别,以ST9和ST121为优势型别。结论 特定ST型别在食品生产过程中存在特定菌株之间的传递,人源性和食源性单核细胞增生李斯特菌中均发现耐药株,可能存在耐药基因的传递,应加强对具有潜在致病性的ST型别的监测力度。     

1例急性淋巴细胞白血病患者感染单核细胞增生李斯特菌病原学及分子分型特征分析

目的对北京市1名急性淋巴细胞白血病患者感染单核细胞增生李斯特菌病例进行病因溯源,对分离到的单核细胞增生李斯特菌进行血清学分型、耐药及分子分型研究。方法对患者不同时期外周血分离的2株单核细胞增生李斯特菌和1株环境涂抹样品单核细胞增生李斯特菌分离株进行血清学分型、耐药性分析、脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分析(MLST)。结果 3株单核细胞增生李斯特菌均为1/2a-3a血清型,耐药结果一致,均对青霉素、氨苄西林、复方新诺明、美罗培南及红霉素敏感,3株菌的PFGE带型一致,MLST型别均为ST155。结论本研究中患者生活环境中存在单核细胞增生李斯特菌的污染情况,高度怀疑患者感染单核细胞增生李斯特菌与其生活环境中分离到的菌株为同一来源。     

台州市食源性单核细胞增生李斯特菌分子特征研究

目的了解台州市食品中分离的单核细胞增生李斯特菌的血清型、毒力基因以及基因分型情况,建立食源性单核细胞增生李斯特菌的分子特征本底信息,为食源性疾病的防治提供技术支持。方法对近几年从食品中分离的37株单核细胞增生李斯特菌进行多重PCR血清分型、9种毒力基因(prf A、inl A、inl B、iap、fla A、hly A、plc B、mpl和act A)PCR检测、PFGE基因分型,用Bio Numerics 6.6软件对分型数据进行聚类分析。结果 37株食源性单核细胞增生李斯特菌的血清型以1/2a或3a型别为主;所有菌株均检出4种以上毒力基因,有15株菌携带所有9种毒力基因;37株菌经Apa I酶切PFGE分型后,共得到22种带型,每种带型包含1~5株不等,相似度区间为67%~100%。结论台州市食源性单核细胞增生李斯特菌存在致病流行风险,建立的指纹图谱数据库可为食源性疾病的防治提供技术支持。     

上海市食源性单核细胞增生李斯特菌MLST分析及毒力基因分布

为了解上海市食源性单核细胞增生李斯特菌亚型和毒力基因的分布情况,于2013年6月至2014年6月在上海市采集各类食品样品,从中分离到86株单核细胞增生李斯特菌,并对其进行多位点序列分型(MLST)及毒力基因检测。MLST分析结果显示:86株单核细胞增生李斯特菌可以分为15个ST型,其中,80.2%(69/86)属于谱系II,其余属于谱系I,未发现谱系III和IV菌株。同时检测了10个毒力基因(prfA,hly,plcA,plcB,actA,clpE,mpl,inlA,inlB和iap),结果发现,这些分离株中10个毒力基因的携带率均为100%。以上结果提示:上海市市售食品中单核细胞增生李斯特菌存在较大的食品安全风险,需加强监测和防控。     

食品中单增李斯特菌的血清分型及脉冲场凝胶电泳分型

对进口食品和国内食品中的单增李斯特菌进行血清学分型和分子分型研究,探讨不同来源菌株之间的遗传相关性及不同分型方法之间的联系。对分离的单增李斯特菌进行血清学分型和脉冲场凝胶电泳分型。69株单增李斯特菌分为4种血清型,主要血清型为1/2a(3a)型,脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型分为55种带型,主要型别为GX6A12.CN0018。食品中的单增李斯特菌分子型别呈现多态性,进口食品分离株和国内食品分离株之间无相关性。     

2000—2018年福建省单核细胞增生李斯特菌分离株血清型及脉冲场凝胶电泳分型

目的 分析福建省食品、临床病例和环境中单核细胞增生李斯特菌分离株的血清型和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,为食源性疾病的暴发识别和溯源提供参考依据。方法 采用多重聚合酶链式反应(PCR)血清学分型、免疫血清凝集和PFGE方法对2000—2018年分离的单核细胞增生李斯特菌进行分型。结果 117株单核细胞增生李斯特菌分为4组血清型,包括1/2a(3a)、1/2b(3b)、1/2c(3c)和4b(4d,4e),占比分别为67.5%(79/117)、23.1%(27/117)、5.1%(6/117)和4.3%(5/117)。9株病例分离株血清型为1/2a(6株)、4b(2株)和1/2b(1株)。采用Asc I限制性内切酶将117株单核细胞增生李斯特菌分为83种不同PFGE型别,其中10株具有独特单一的型别。9株病例分离株分为8种不同PFGE型别。结论 福建省食品和病例中分离的单核细胞增生李斯特菌,1/2a血清型占主导地位,4b血清型应引起关注。     

单核细胞增生李斯特菌的毒力基因检测及PFGE分型的研究

目的了解福建省食品中单核细胞增生李斯特菌携带hly、plcA、plcB和prfA毒力基因的情况及脉冲场凝胶电泳(PFGE)的分型情况。方法将hly、plcA、plcB和prfA基因作为靶序列选取4对引物,通过聚合酶链反应(PCR)检测61株单核细胞增生李斯特菌和2株可疑单核细胞增生李斯特菌的毒力基因,用PulseNet单核细胞增生李斯特菌标准方法进行7株单核细胞增生李斯特菌的PFGE分子分型。结果61株单核细胞增生李斯特菌毒力基因为hly 、plcA 、plcB 和prfA ,2株可疑单核细胞增生李斯特菌的毒力基因分别为hly-、plcA 、plcB-、prfA-和hly-、plcA-、plcB-、prfA-。7株单核细胞增生李斯特菌的PFGE分为5个型。结论实验结果表明福建省食品中分离到的单核细胞增生李斯特菌均含有hly、plcA、plcB和prfA基因,属于致病株。对2株可疑单核细胞增生李斯特菌进行了进一步的鉴定,排除了单核细胞增生李斯特菌,该毒力基因检测方法可用于可疑单核细胞增生李斯特菌的进一步鉴别。7株菌中有两对2株PFGE型别一致,一致的菌株来自不同年份不同销售地点的同一品牌,应用PFGE方法可以进一步调查该厂冻鸡肉中单核细胞增生李斯特菌的传播途径和污染源。     

采用高级微生物基因分型系统对食品中单核细胞增生李斯特菌进行同源性分析

采用高级微生物基因分型系统(DiversiLab系统)对食品中单核细胞增生李斯特菌进行基因型分析,将分型结果与血清型和菌株的耐药性进行比对研究。方法 DiversiLab系统是基于rep-PCR原理对微生物进行分型,将分型结果与菌株的血清型进行比较研究,同时对菌株的耐药性与rep-PCR型别进行研究。结果 采用DiversiLab系统将46株单核细胞增生李斯特菌分为9个型别A～I。血清型为1/2a的分离株以A型为主,所测试的6株血清型为4b的分离株均为H型;14株呋喃妥因耐受菌株9株为A型、1株为B型、3株为C型、1株为F型,除2株血清型为3a外,其余均为1/2a。结论 DiversiLab系统分析结果,揭示了46株从食品中分离的单增细胞增生李斯特菌间的亲缘关系,rep-PCR分型结果与H抗原结合位点存在一定联系,呋喃妥因耐受菌株的DNA指纹图谱相似度高,与耐药基因有关。     

2012年中国食源性单核细胞增生李斯特菌耐药特征及多位点序列分型研究

研究2012年中国23个省市自治区10类食品中分离的635株单核细胞增生李斯特菌的耐药特征及多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)测定。方法 采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法,选择氨苄西林、复方新诺明、四环素、庆大霉素、红霉素、环丙沙星、氯霉素和万古霉素8种抗生素,对耐药株进行MLST分型。结果 635株单增李斯特菌检测出66株耐药菌,平均耐药率为10.39%。耐四环素菌株最多为49株,其次为耐环丙沙星20株、红霉素10株、氯霉素7株、复方新诺明3株、氨苄青霉素1株、庆大霉素1株、万古霉素1株。耐受2种抗生素有8株,耐受3种及以上抗生素有7株。77株菌耐药性介于中介度,其中75株菌对环丙沙星耐药性介于中介度。耐药株MLST分型表明,ST155、ST9、ST705和ST87为我国单增李斯特菌耐药株常见型别。四环素和四环素-红霉素-氯霉素耐药谱在MLST聚类分析中有集中趋势,耐药菌株主要来源于熟肉制品和中式凉拌荤菜。结论 我国目前食品来源的单增李斯特菌耐药率普遍较低,但与往年相比呈现逐渐增加的趋势。耐药株的主要MLST型别分布与相关耐药谱在聚类分析中相互关联。     

即食食品中单核细胞增生李斯特菌的血清学分型和毒力基因分析

目的掌握即食食品中单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)的血清型、谱系和感染相关基因的分布。方法以全国食源性致病菌监测网中2007—2009年自即食食品分离的226株单增李斯特菌为研究对象,采用传统的血清学分型技术和等位基因特异性寡核苷酸PCR方法(ASO-PCR)研究其血清学分型,并采用PCR方法检测其与感染相关的基因。结果 226株单增李斯特菌血清学分型结果显示,1/2a、1/2b、1/2c、4b为主要血清型,比例分别为41.59%(94/226)、40.71%(92/226)、10.62%(24/226)和5.31%(12/226)。引起人类疾病的常见血清型1/2a、1/2b和4b菌株占87.61%(198/226)。谱系Ⅰ菌株为105株,谱系Ⅱ菌株为120株,谱系Ⅲ菌株为1株;我国绝大部分即食食品中单增李斯特菌分离株的感染相关基因缺失率较低,只有个别菌株缺失感染相关基因。结论本研究通过对分离自即食食品中的单增李斯特菌进行血清学分型、谱系分析和感染相关基因的检测,提示我国需要加强食品场所卫生管理,降低单增李斯特菌对即食食品的感染风险。     

温州地区蜡样芽胞杆菌分型特征研究

目的了解温州地区不同来源蜡样芽胞杆菌毒力基因分布、生化分型和多位点序列分型(MLST)特征。方法参照GB 4789.14—2014对127株蜡样芽胞杆菌进行鉴定和生化分型,同时采用PCR方法检测10种毒力基因,并进行MLST基因分型。结果 127株蜡样芽胞杆菌同时携带Nhe A、Nhe B、Nhe C基因的菌株占94.5%(120/127),而同时携带hbl A、hbl C、hbl D基因的占9.4%(12/127),携带ces基因的占7.9%(10/127);127株菌株除10株不能进行生化分型外,其余117株分为2型(0.8%,1/127)、5型(3.9%,5/127)、8型(1.6%,2/127)、9型(63.8%,81/127)和10型(22.0%,28/127);通过MLST分析,72株菌株共分为28个ST序列型,ST26(18.1%,13/72)、ST144(15.3%,11/72)、ST92(6.9%,5/72)和ST164(6.9%,5/72)为常见ST型别。28个ST型聚类分析显示温州地区蜡样芽胞杆菌分为4个序列群和13个单态群。结论温州地区蜡样芽胞杆菌毒力基因携带率较高,遗传关系具有多样性。     

新疆食源性单增李斯特菌MLST分型及耐药性分析

目的 为了解新疆食源性单增李斯特菌分型和耐药情况。方法 将62株食源性和1株羔羊脑炎分离株进行多位点序列分型(MLST)及耐药性试验。结果 63株单增李斯特菌分为20个ST型,16个克隆群(CC),其中68.25%(43/63)属于谱系II,其余属于谱系I。优势ST型是ST8、ST9、ST121、ST87和ST378,优势CC群是CC8、CC9、CC1和CC121。对P、AM和OX1 3种抗生素耐药率达100%;对GM、MXF、E、QDA、LNZ、VA、TGC、RA和ICR 9种抗生素敏感率达100%;对FT耐药率61.90%,其中ST7、ST8、ST101、ST155和ST515对此次的3-4类药物表现出多重耐药性。结论新疆单增李斯特菌分子型别呈多样性,耐药谱变宽,存在较大的食品安全风险。     

基于全基因组测序的单核细胞增生李斯特菌食品分离株分子特征分析

目的 了解肇庆市单核细胞增生李斯特菌(以下简称单增李斯特菌)食品分离株的基因组特征、毒力岛的携带情况及遗传多样性。方法 对肇庆市13株单增李斯特菌食品分离株进行全基因组测序,将组装好的contings/Scaffolds上传至在线分析平台Center for Genomic Epidemiology、Rast和VFanalyzer进行基因组注释与毒力因子基因鉴定,并应用基于全基因组测序的单核苷酸多态性分型(wg-SNPs)方法与美国生物技术信息中心(NCBI)上获取的25株国内外单增李斯特菌的基因组进行遗传进化分析。结果 13株单增李斯特菌食品分离株的基因组大小为2.82～3.04 Mb,CG含量为37.9%～38.1%,可分为6个ST型(ST1、ST3、ST8、ST59、ST87、ST101),分属于6个克隆复合群(CC1、CC3、CC8、CC59、CC87、CC101)。其中,ST3型菌株均携带LIPI-3毒力岛基因,ST87型菌株均携带完整LIPI-4毒力岛基因。wg-SNPs遗传进化分析显示13株单增李斯特菌食品分离株可分为2个进化分支,其中ST3型菌株位于进化树的根部,与其他ST型菌株进化上存在差异。结论 肇庆市单增李斯特菌食品分离株以高毒力的ST87型和ST3型为流行型,并发现一株同时携带LIPI-1～LIPI-4毒力岛的ST87型菌株,应加强对此类菌株的监测,警惕高毒力菌株在肇庆市引起感染性暴发的风险。     

出入境动物源性食品中单增李斯特菌的多位点序列分型分析

对出入境动物源性食品中分离的单增李斯特菌进行多位点序列分型（mutilocus sequence typing,MLST）分析,了解其序列型分布特点及不同菌株之间的亲缘关系。提取单增李斯特菌基因组DNA,选择其7 个管家基因进行聚合酶链式反应扩增并测序。将测序结果截成标准序列的长度后上传到MLST数据库进行比对分析,获得7 个管家基因的等位基因谱和序列分型编码,并将结果采用不加权算术平均组对（unweighted pair group method usingarithmetic averages,UPGMA）法进行聚类分析。89 株单增李斯特菌共获得51 个STs,其中26 个为新获得的STs（STnew1～STnew26）;数量最多的5 个STs为ST8（9.0%）,ST121（9.0%）、ST7（5.6%）、ST87（5.6%）及新发现的STnew3（7.8%）;其中ST456、ST34、ST343、ST19、ST517、ST201、ST98、ST330和ST73为在国内首次获得。采用UPGMA算法得到的进化树可将89 株菌株分为3 大类群,分类的结果与单增李斯特菌血清学家系分类结果一致。MLST结果对了解出入境动物源性食品中分离的单增李斯特菌的亲缘关系及流行病学溯源有重要意义。     

Characterization of Listeria monocytogenes isolates in import food products of China from 8 provinces between 2005 and 2007

A total of 48 Listeria monocytogenes isolates of different import food products from 8 provinces between 2005 and 2008 were characterized. The serotype and virulence were confirmed for each strain and molecular subtyping were analyzed by multilocus sequence typing (MLST). Twenty five strains were assigned to serotype 1/2a, and 11 isolates to serotype 1/2b, serotype 4b were found in 7 isolate, and the remaining 5 strains were grouped into serotypes 1/2c, 4a, and 4e. Molecular subtyping schemes found thirty two sequence types (STs) among these isolates and the majority of L. monocytogenes strains belonged to lineage II (56%), followed by lineage I (38%), lineage III (6%). Two molecular subtype clusters, cluster A included all isolates of lineage II, while cluster B contained the isolates of lineages I and lineages III. Two L. monocytogenes strains were not grouped in either of the two clusters. Fifty three isolates were as virulent as L. monocytogenes reference strain EGD in mouse virulence assay, while the isolates 22213 and 22265 had low pathogenicity. These results provide the first molecular insight into the L. monocytogenes strains isolated from import food products of 8 provinces in China and indicate the potential risk to cause human disease if intake by contaminated foods. MLST could be used as a routine subtyping method of L. monocytogenes isolates. In China, inspection and quarantine strategies of imported foods should be strengthened. PRACTICAL APPLICATION: There is a potential risk of listeriosis in China and routine subtyping of L. monocytogenes isolates is important. It is necessary for food hygiene management to strengthen the supervision of imported foods.     

Virulence characterization and genotypic analyses of Listeria monocytogenes isolates from food and processing environments in eastern China

In this study, twenty L. monocytogenes food-related isolates collected from eastern China Zhejiang province were compared by in vivo LD50 assays as well as in vitro cytopathic plaque forming assay. Nineteen L. monocytogenes isolates (19/20) were as virulent as reference strain 10403S, while the isolate M4 had low pathogenicity. The unique isolate M4 fell into lineage III based on the partial nucleotide variations of actA, while the other isolates belonged to the more common lineages I and II. L. monocytogenes isolates were grouped in 17 to 19 subtypes using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) with SmaI digestion, and multilocus sequence typing (MLST) based on three virulence genes (actA, inlA and inlB) and four housekeeping genes (betL, dat, recA and sigB). The virulence genes based MLST had better discriminatory power than that targeting the housekeeping genes (0.990 vs 0.895), similar to PFGE (0.976). An isolate from the processing desk was found having the same pulsotype as the two isolates from final shrimp products in the same plant, indicating that process contamination could be the source of Listeria contamination.     

成都市海产品中副溶血性弧菌耐药特征及多位点序列分型

目的了解成都市不同种类的海产品中副溶血性弧菌的污染程度、耐药情况、毒力基因分布、基因分型情况,为成都市食源性副溶血性弧菌流行及其风险评估提供基础数据。方法参照GB 4789. 7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》,从不同种类的海产品中分离副溶血性弧菌疑似菌株,通过生化试验及16S r DNA测序进行准确鉴定;采用纸片扩散法对分离株进行药敏试验,通过聚合酶链式反应(PCR)检测与其致病性相关的2个毒力基因,对分离株进行多位点序列分型分析。结果从采集的380份海产品中共104份样品检出副溶血性弧菌,总检出率为27. 4%。药敏试验表明,97. 1%(101/104)的分离株具有耐药性,其中对氨苄西林的耐药率最高(95. 2%,99/104)。分离株trh基因携带率为12. 5%(13/104),tdh基因携带率为1. 0%(1/104); 104株分离株共分为38个ST型,其中ST1801、ST392、ST413型分离率较高,分离株未出现流行克隆群。结论流通过程中不同种类海产品副溶血性弧菌污染率、耐药情况、毒力基因分布存在差异,可能与养殖环境、运输条件等有关。     

婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染调查及分子分型研究

目的了解温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染情况及分子分型特征,分析不同菌株间亲缘相关性。方法参照GB 4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法在食品中分离鉴定克罗诺杆菌。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对克罗诺杆菌进行分型研究。结果 2013—2017年共采集737份婴幼儿食品和配方奶粉,克罗诺杆菌总检出率为6.1%(45/737)。其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高(23.4%,37/158)。45株克罗诺杆菌属于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)和莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。其中阪崎克罗诺杆菌最多(73.3%,33/45),其次为丙二酸盐克罗诺杆菌(24.4%,11/45)。MLST共分为25个ST型,其中ST64、ST1、ST40、ST4和ST7为优势型别。45株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。PFGE型和MLST型结果分析表明,绝大数具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌的污染状况较轻,其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高。食品来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性。     

2019年北京市食源性单增李斯特菌的分子特征和耐药性研究

研究2019年北京市食源性单增李斯特菌进行分子特征和耐药性。 方法 使用多重PCR进行血清群分型、对分离的56株菌进行脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）、多位点序列分析（multilocus sequence typing, MLST）,使用微量肉汤法检测菌株的耐药性。 结果 56株单增李斯特菌中有28株分离自冷锅串串和中式凉拌菜,1/2a, 3a是主要的血清群。56株菌共分为29个PFGE带型、14个ST型,ST9、ST5、ST8、ST121是其主要的ST型别。2株菌对环丙沙星耐药,1株菌对四环素耐药。结论 冷锅串串和中式凉拌菜是单增李斯特菌污染的高危食品。北京市食品来源单增李斯特菌的ST型别与国内其他地方食品来源菌株一致,与北京市临床分离株一致。