一种快速筛查志贺氏菌的荧光纳米免疫层析方法的建立

本文以建立志贺氏菌荧光纳米颗粒免疫层析法为目的。首先,制成志贺氏菌单抗-荧光纳米颗粒偶联物,以双抗体夹心模式制备志贺氏菌免疫层析试纸条。利用微型手持荧光检测仪读出质控线和检测线上的荧光信号,并利用荧光强度来半定量检测志贺氏菌。结果显示:用本研究建立的荧光纳米颗粒试纸条检测30株菌,对宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌呈阳性结果,其余菌株的呈阴性结果,试纸条灵敏度为9.0×104 CFU/m L。用志贺氏菌免疫层析试纸条和标准法检测60份样品,两种方法的总符合率为88.3%。结论:本研究成功建立了志贺氏菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测志贺氏菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。     

量子点标记荧光免疫试纸条可视化检测肉品中志贺氏菌研究

志贺氏菌是一类具有强传染性和危害严重的革兰阴性食源性致病菌。该文利用自制的CdTe量子点偶联志贺氏菌单克隆抗体,将志贺氏菌单克隆抗体和羊抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维素膜,并分别作为试纸条检测线和质控线,研制一种可视化检测志贺氏菌的量子点免疫荧光试纸条。该试纸条对肉类实际样品的检测限为1×104 CFU/mL,单个样品检测时间只需15 min,对常见的5种食源性致病菌均无交叉反应性。该方法构建的基于量子点免疫荧光试纸条满足快速、可视化、高灵敏检测志贺氏菌需求,可用于肉类食品的快速检测。     

双抗夹心ELISA快速检测冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a

为建立冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a双抗夹心ELISA检测体系,采用福氏志贺氏菌2a抗原免疫获得多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选出1株福氏志贺氏菌2a单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为2C10。试验结果表明,2C10杂交瘤细胞株抗体效价为1∶10.24×104,抗体纯度为96%,免疫球蛋白亚型为IgG2a。用此单克隆抗体作为检测抗体,多克隆抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心ELISA体系,检测限为1 000 CFU/g。用此体系检测宋内志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌及阪崎肠杆菌,均无交叉反应。本研究可为冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a的检测提供一种特异性强,准确度高的ELISA检测方法。     

4种分离培养基检测志贺氏菌效果比较

志贺氏菌是一类具有高度传染性的肠道致病菌。文中基于GB 4789.5—2012《志贺氏菌检验》标准,比较了4种分离培养基检测志贺氏菌的效果。通过4种分离培养基对福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌的回收率、最低检出限及对不同样品检测效果的比较,对不同培养基的检测效果进行评价。结果显示4种分离培养基最低检出限相近,显色培养基01检测特异性优于其他3种;针对实际检测样品,应灵活选择培养条件,以提高检测的准确性及效率。     

副溶血弧菌胶体金检测试纸条的改进

研制一种快速、灵敏、简便的胶体金免疫试纸条,用于改进副溶血弧菌的检测。通过胶体金与特异性针对于副溶血弧菌的单抗偶联,同时在NC膜上包被兔多抗、驴抗鼠的IgG分别作为检测线和质控线,制备免疫层系试纸条,测定试纸条的灵敏性与特异性。结果表明,当加入由胶体金标记的羊抗鼠二抗,能将显色强度提高5倍,明显有利于肉眼的观察。在纯培养物中试纸条的灵敏度为106CFU/mL,且与3株不同的副溶血弧菌均有阳性反应,与26株常见的菌均无交叉反应。同时在添加阪崎肠杆菌、志贺氏菌的鱼肉样本中,检测限为107CFU/mL。改良的副溶血弧菌胶体金免疫层系试纸条的建立,有助于加强食品中该菌的检测,提供了一种快速、灵敏、简便的方法。     

反转录-环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌

建立了反转录-环介导等温扩增技术的志贺氏菌快速检测方法。针对志贺氏菌特异保守基因ipa H设计多套引物,建立优化了的反应体系,并评价其准确性、特异性、灵敏度。以人工污染脱脂乳样品比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度。结果表明,在65℃等温条件下,RT-LAMP反应可在30 min内完成。在活菌/损伤菌模型中,该方法表现出比国标法更好的准确性。在23株细菌标准菌株中仅对4株志贺氏菌有特异性检出。志贺氏菌RNA模板的检测灵敏度为7 fg/μL。人工污染脱脂乳样品检测灵敏度达到40 CFU/g,比RT-PCR方法高出2个数量级。表明所建立的志贺氏菌RT-LAMP扩增方法可以准确的检测志贺氏菌,同时具有快速、特异、灵敏的优势,可用于志贺氏菌的快速筛查和现场监控。     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipa H基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44 min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16 fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3 CFU/m L;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8 CFU/m L。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

抗志贺氏菌IgY的提纯及建立间接ELISA检测志贺氏菌

采用水稀释法提纯抗志贺氏菌IgY,检测10mg/mL纯化抗志贺氏菌IgY的效价为1∶320,并以此IgY为基础建立间接ELISA检测志贺氏菌,测定志贺氏菌纯培养液的检出限为105～106cfu/mL。对蜡样芽孢杆菌等10株不同菌株的检测结果表明,该方法对志贺氏菌有明显的检测特异性,对所测定的其它菌株无交叉反应。     

奶粉中病原菌质控考核结果分析

目的 对质控考核样品进行检测, 分离鉴定肠杆菌科志贺氏菌属A群痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌, 并分析其中特别的生物学现象。方法 按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 (GB 4789.5-2012)》对考核检样进行检测。结果 分离出宋内志贺氏菌而未分离出金黄色葡萄球菌, 并在检验过程中观察到特别的生物学现象。结论 志贺氏菌在志贺氏菌属显色培养基上并非显示一样颜色, 有白色菌落周围培养基显示紫红色,也有黄色菌落周围培养基显示黄色。     

量子点免疫标记法检测福氏志贺氏菌

研究基于抗原抗体反应捕获目标菌,结合生物素与亲和素间的特异性相互作用,联合免疫纳米磁珠磁性分离、免疫量子点荧光标记技术,运用荧光检测系统,建立了福氏志贺氏菌的定量检测模型。结果表明,福氏志贺氏菌菌浓度为102CFU/mL~105CFU/mL,相对荧光强度与菌浓度关系为FI=12.78lgN+15.941,呈良好的线性关系,决定系数R2=0.9761。进一步对模型的准确度和精确度进行验证,得到菌落浓度预测值与真实值差异小,检测相对标准偏差为1.8%,表明模型的准确度好,精密度高。该方法可简单、快速（2h）、高效地检测福氏志贺氏菌。     

胶体金免疫层析法联检食品中5 种典型沙门氏菌模型的建立和优化

采用胶体金标记抗沙门氏菌单克隆抗体,将沙门氏菌单克隆抗体和驴抗鼠抗体（二抗）喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,研制能联检5 种典型沙门氏菌（甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌）的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,该试纸条能达到同时检测5 种沙门氏菌的目的,其中甲型副伤寒沙门氏菌的检测灵敏度最高,为105 CFU/mL;鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌的检测灵敏度为106 CFU/mL。沙门氏菌加入量为10～100 CFU时,增菌16～20 h,该试纸条能够检测出牛奶、鸡蛋样本中的5 种沙门氏菌。本实验研制的试纸条能快速高效地联检食品中5 种典型的沙门氏菌,特异性高、灵敏度好,在对多种沙门氏菌进行联检方面有很重要的应用价值。     

高灵敏度磁荧光免疫层析试纸模式构建及在呕吐毒素检测中的应用

构建基于磁荧光纳米材料的免疫层析试纸模式,弥补现在免疫层析技术的不足,为更灵敏的免疫学快速检测提供技术支撑。以呕吐毒素（deoxynivalenol,DON）为靶标,采用溶剂热法制备羧基修饰的超顺磁颗粒,碳二亚胺法将磁颗粒、绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体进行偶联,一步法制备磁荧光抗体探针,以DON人工抗原（DON-BSA）为检测线建立磁荧光免疫层析试纸。同时用胶体金标记DON单克隆抗体,以DON-BSA为检测线建立胶体金免疫层析试纸;制备的磁荧光抗体探针具有很好的磁性、荧光特性及抗体反应性,基于该探针成功制备了DON磁荧光免疫层析试纸,该试纸回归方程为y=－0.562x＋0.921,R2=0.990,IC50为5.611 ng/mL,检出限为1.089 ng/mL;制备了DON胶体金免疫层析试纸,该试纸裸眼检测灵敏度为500 ng/mL;定量检测回归方程为y=－0.543x＋1.485,R2=0.991,IC50为65.16 ng/mL,检出限为11.94 ng/mL。DON磁荧光免疫层析试纸的灵敏度是胶体金免疫层析试纸的10.96 倍。本实验建立的磁荧光免疫层析试纸模式可以同时实现样品的富集及荧光信号检测,提高检测灵敏度,并成功用于DON的检测,为磁荧光纳米颗粒广泛应用于免疫层析领域提供参考。     

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的研制

采用胶体金标记抗大肠杆菌O157:H7 单克隆抗体(鼠源),通过将大肠杆菌O157:H7 多克隆抗体和驴抗鼠抗体(二抗)喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,研制大肠杆菌O157:H7 胶体金快速检测试纸条。通过优化实验,确定最佳条件为标记量16.8μg/mL、标记pH8.0、封闭剂PEG20000、检测时样品最佳pH7.0～7.5。对26 株常见细菌交叉反应结果表明,该试纸条除与鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311 和金黄色葡萄球菌CMCC 26003 有轻微交叉反应外,与其他24 株菌均无交叉反应。该试纸条灵敏度为104CFU/mL。用该试纸条检测大肠杆菌O157:H7操作简便、快捷、灵敏度高、特异性强。     

基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丁香酚

目的 采用免疫层析技术对丁香酚残留的胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备开展研究。方法 用柠檬酸三钠还原法制备胶体金纳米颗粒, 标记丁香酚单克隆抗体得到胶体金-丁香酚单克隆抗体复合物。以硝化纤维素膜为固相载体, 包被丁香酚-BSA偶联物为检测带(T带), 羊抗鼠IgG为质控带(C带), 建立了丁香酚的胶体金免疫层析快速检测试纸条。结果 胶体金免疫层析试纸条具有较高的灵敏度和特异性, 检出限为2.0 mg/L。结论 本研究所开发的胶体金免疫层析试纸条可作为快速测定丁香酚的可靠、低成本的方法。     

A Chromatographic Strip for Rapid Semi-quantitative Detection of H5 Subtype Avian Influenza Viruses in Poultry

An immunochromatographic strip was developed for rapid semi-quantitative of the H5 subtype of avian influenza viruses (H5 AIVs) in poultry. A specific monoclonal antibody 1C4 for H5 AIV hemagglutinin (HA) was produced and conjugated with colloidal gold as the detecting probes for the immunochromatographic strips, and a polyclonal antibody against H5N1 was used to firm the test line. Different from the traditional strips, four test lines with a same capture complex of different concentrations were designed on the nitrocellulose membrane. By contrast with the HA tests and the simulated infection experiment, the immune strip was proved to be specific for the detection of H5 AIV within 10 min and had the character to reflect the viruses infection degree in different organs of the infected poultry. It should be useful for diagnosing and semi-quantitative analysis of the H5 subtype of AIV.     

Development of a rapid immunochromatographic strip for detection of Escherichia coli O157

We developed an immunochromatographic (IC) strip for the rapid detection of Escherichia coli O157 in enriched samples. Murine monoclonal antibody to E. coli O157:H7 lipopolysaccharide was conjugated with 40 nm of colloidal gold particles by the citrate method. The specificity of the IC strip was determined using 48 pure-cultured bacteria, including 32 E. coli strains and 16 non-E. coli strains. Regardless of H serotype, E. coli O157 strains produced a positive signal, whereas the others, representing 29 E. coli serotypes, did not. Among 16 non-E. coli strains, only Citrobacter amalonaticus yielded a positive signal. The sensitivity of the IC strip was determined using 10-fold diluted E. coli O157:H7, with a range of 1.8 X 10(7) to 1.8 CFU/ml in enriched raw beef. E. coli O157 could be detected at a minimum of 1.8 x 10(5) CFU/ml without enrichment and 1.8 CFU/ml after enrichment. Various samples were enriched to detect E. coli O157 using the IC strip and to isolate E. coli O157:H7 using traditional culture procedures. The IC strip test results exhibited 100% agreement with traditional methods after selective enrichment, since E. coli O157:H7 was also isolated from all the samples with positive strip test results. However, the specificity of the strip was somewhat higher with pork (98.8%) than with bovine feces (87.9%) and swine feces (93.4%). These results indicated that the IC strip exhibits high specificity and sensitivity in the detection of E. coli O157, and this assay is rapid, economical, and simple, without requirement of complicated equipment.     

荧光免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测单增李斯特菌

为建立单增李斯特菌简单快速、灵敏度高和特异性强的检测方法,本研究以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠;以羧基荧光微球标记的抗单增李斯特菌多克隆抗体及鼠IgG为标记抗体,抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠二抗分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离与荧光免疫层析法相结合应用于单增李斯特菌的现场快速检测中。结果表明:荧光免疫层析试纸条对纯培养单增李斯特菌的检测限为4×105CFU/mL,联合检测方法10倍、100倍浓缩时,检测限分别为4×104CFU/mL和1×104CFU/mL。联合检测体系特异性较好,与实验室保存的10株细菌无交叉反应。人工污染样本检测限为1×104CFU/mL,同纯培养物相比检测灵敏度并没有降低。本方法的建立对于食品中单增李斯特菌的现场快速检测具有重要意义。     

双酚A快速检测胶体金试纸的研制

为建立一种快速检测双酚A(BPA)的方法,本论文建立以胶体金为基础的免疫层析法(GICA)。首先通过BPA人工抗原免疫Balb/c小鼠,然后利用正常的杂交瘤技术制备BPA的单克隆抗体,所制备的抗体经过辛酸-硫酸铵(CA-AS)沉淀法纯化后并鉴定为IgG2b亚型。胶体金是由柠檬酸三钠还原氯金酸而制得,通过紫外扫描光谱和透射电镜检测,结果表明胶体金在530 nm有单一吸收峰、粒径约为30 nm。用其标记BPA单克隆抗体,制备金标抗体。本研究所制备的胶体金免疫层析试纸条的检测限为100 ng/mL,检测时间为10 min,交叉反应表明,试纸条和BPA的结构类似物双酚酸、任基酚和辛基酚无交叉反应,有良好的再现性。该方法能够方便、快捷、有效的检测环境中的BPA,免疫层析试纸的研制为BPA进行现场快速的检测奠定了基础。     

Rapid and Sensitive Immunochromatographic Strip for On‐site Detection of Sulfamethazine in Meats and Eggs

A rapid immunochromatographic (ICG) strip based on a conjugate of colloidal gold and monoclonal antibody (mAb) was developed for the rapid, sensitive, and on‐site detection of sulfamethazine in meat and egg samples. The detection limit of the ICG strip is 2 ng/mL, and the assay can be completed in 10 min. A cross‐reactivity test indicated that the ICG strip was highly specific to sulfamethazine with no cross‐reaction with sulfonamide compounds and other antibiotics. The results of the recovery test from meat and egg samples spiked with sulfamethazine were in good agreement with those obtained by the indirect competitive enzyme‐linked immunosorbent assay. These results demonstrated that the ICG strip can be used as a rapid and qualitative tool for on‐site screening of sulfamethazine in meat and egg samples.