一株椰糠纤维降解菌的分离、鉴定及特性研究

以椰糠作为碳源,从红树林土壤中分离了一株高产纤维素酶的真菌,命名为DZ10。经形态、生理生化和分子生物学试验,鉴定菌株DZ10为长枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）。该菌在pH值为6.5、培养温度为35 ℃、初始NaCl含量为2.0%、添加K+终浓度为0.1 mmol/L条件下,椰糠降解率最高为39.88%;在pH值为6.5、培养温度40 ℃、初始NaCl含量3.0%、添加K+终浓度为0.1 mmol/L条件下,羧甲基纤维素酶活力（CMCA）最高值为80.07 U/mL;在pH值为6.0、培养温度35 ℃、初始NaCl含量1.5%、添加K+终浓度为0.1 mmol/L条件下,滤纸酶活力（FPA）最高值为73.81 U/mL。Ca2+、K+对菌株DZ10产酶和椰糠降解率有促进作用,Mg2+抑制菌株DZ10产酶和椰糠降解率。     

醋蛋多肽血管紧张素转化酶抑制活性的稳定性研究

研究了温度、pH、金属离子、食盐及食品中常见糖类和防腐剂对醋蛋多肽血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的影响。结果表明:醋蛋多肽的ACE抑制活性对热不稳定,对pH稳定;当金属离子浓度达到5mmol/L时,醋蛋多肽的ACE抑制活性有较明显的下降,其影响大小顺序为K+>Zn2+>Cu2+>Ca2+>Mg2+;食盐能降低醋蛋多肽的ACE抑制活性;在实验浓度范围内,葡萄糖、蔗糖、乳糖、苯甲酸和山梨酸对醋蛋多肽ACE抑制活性影响不大。     

5种金属离子对紫色红曲霉主要次生代谢物谱的调节作用

目的:研究金属离子对紫色红曲霉生长和主要次生代谢物合成的调节作用。方法:将紫色红曲霉孢子接种到含不同浓度的金属离子（Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+）的固体培养基,观察不同离子对其生长和色素合成的影响;同时,将不同浓度的上述离子及金属螯合剂8-羟基喹啉分别接种到液体培养基中,测定紫色红曲霉生物量、红曲色素、莫纳克林K、γ-氨基丁酸和桔霉素等主要次生代谢物含量及发酵液中代谢物谱变化。结果:Cu2+（0.5 mmol/L）处理导致水溶红、橙、黄色素产量分别提升了2.01、2.07和1.73倍;醇溶色素分别增加了2.83、1.74和1.95倍;莫纳克林K和桔霉素分别增加了1.78和5.53倍。Zn2+（0.5 mmol/L）促使水溶、醇溶色素分别增加了93.3%、78.6%、57.6%和2.9、1.54、0.54倍。莫纳克林K和桔霉素则分别增加了0.92和6.91倍。0.5 mmol/L的Mg2+处理导致生物量有所下降,但无显著差异;水溶、醇溶色素则分别增加了2.68、2.25、2.02倍和1.26、1.23、1.82倍;莫纳克林K则增加了51.8%。0.25 mmol/L的Mg2+则使桔霉素提升了1.79倍。Mn2+（0.5 mmol/L）刺激水溶、醇溶色素产量分别增加了48.3%、29.9%、24.8%和131.1%、83.6%、49.2%,莫纳克林K增加了1.01倍。而桔霉素则在1 mmol/L Mn2+刺激下增加了92.3%。Co2+（0.5、1 mmol/L）导致生物量分别降低了47.9%和53.7%,而醇溶色素则分别提高了4.07、5.04、2.62倍和3.07、3.41、2.70倍,对莫纳克林K合成无作用;桔霉素产量分别降低了90.8%和93.9%。上述离子均不利于γ-氨基丁酸的合成。金属离子螯合剂8-羟基喹啉（20 μmol/L）使红曲霉生物量降低了26.9%,水溶色素分别下降了40.6%、34.3%和26%。莫纳克林K和桔霉素分别降低了56.7%和90.1%。发酵液的波谱（200~600 nm）扫描结果发现,金属离子仅调节代谢物的产量,并不改变紫色红曲霉代谢物种类。结论:金属离子不仅影响紫色红曲霉的生长,并显著调节其主要次生代谢物谱。     

基于宏基因策略的新颖木聚糖酶基因cbxynA克隆及其重组酶酶学性质

研究构建了库容量约为1.3×104个克隆子且外源片段的总长为30 Mb的土壤宏基因组文库。基于功能策略,从文库中筛选到分解木聚糖底物的阳性克隆子。该克隆经序列分析发现一个822 bp的潜在的编码木聚糖酶基因(cbxynA)的开放阅读框,其编码的氨基酸序列与来自古细菌属编码的木聚糖酶的相似度最高仅为45%,说明该序列为一条未知的新序列。cbxynA在大肠杆菌中的重组表达产物的分子质量为29 ku,与预测结果一致。对其原核表达条件进行优化,结果表明:质粒在培养5 h后加入0.7 mmol/L IPTG,23℃下诱导25 h后表达,木聚糖酶活力为52 U/mL,较初始值提高4.3倍。而重组酶(CBXYNA)最适pH和最适温度分别为5.2和55℃。金属离子Na+、K+、Li+、Ca2+能提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+能抑制其活性。该酶以水溶性玉米芯木聚糖、燕麦木聚糖、水不溶性木聚糖为底物时,其相对酶活力分别为162%,139%,74%。     

金属离子对红发夫酵母的生长、细胞形态及虾青素合成的影响

主要研究了Mn2+、Mg2+和Ca2+三种金属离子对红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)的生长、细胞形态及虾青素生物合成的影响。结果表明,在种子培养基中添加Mn2+能明显提高红发夫酵母的β-D-葡萄糖苷酶的活性并改变细胞的形态;在发酵培养基中添加0.1g/LMn2+,能明显促进细胞生长及虾青素合成;用正交试验法优化得到发酵培养基中的金属离子浓度为:0.1g/LMn2+、0.7g/LMg2+、0.2g/LCa2+,在优化后的培养基中,细胞生长速度快,摇瓶发酵57h的虾青素产量达2.95mg/L,是不加金属离子情况下发酵产虾青素最大量(发酵72h)的1.31倍。     

肠膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶的酶学性质及转糖苷分子改造

根据GenBank数据库公布的肠膜明串珠菌ATCC 12291中蔗糖磷酸化酶基因序列,构建重组表达质粒pQE-lmsp。在大肠杆菌Escherichia coli M15/pREP4中诱导表达,镍亲和层析纯化蛋白,进行酶学性质测定和重组酶转糖苷活性的研究。以蔗糖为底物对LMsp进行酶学性质分析,其最适温度和最适pH值分别为40 ℃和6.5;Km值和Vmax值分别为（34.16±1.219）mmol/L和（370.5±6.049）μmol/（mg·min）。当以葡萄糖-1-磷酸为供体时,对于大多数单糖及其糖醇类受体均具有转糖苷活性,尤其对L-阿拉伯糖具有75%的转化效率。然后通过对LMsp进行同源建模和氨基酸序列比对分析,进行分子改造,并比较酶学性质及转糖苷活性的变化。获得7 个单点和联合的突变体T180A、T219V、P236S、T180A-T219V、T180A-P236S、T219V-P236S、T180A-T219V-P236S,其中突变体T180A、P236S对L-山梨糖的转糖苷活性分别有13.7%和15%的提高。本研究通过对LMsp的研究,发现其具有良好的酸碱稳定性和对L-阿拉伯糖的高转糖苷活性,并且获得了对于L-山梨糖转糖苷活性提高的突变体,丰富了有关于蔗糖磷酸化酶的性质,并且对该酶的分子改造提供了经验依据。     

茶树单宁酶的原核表达及酶学性质表征

基于大肠杆菌的密码子偏好性，对茶树单宁酶基因CsTanA碱基进行优化，基因优化后GC含量为51.9%，密码子适应指数为0.8，优化前后基因序列的一致性为77.8%，以pET-30a为表达载体对优化基因进行重组表达及酶学性质分析。A600 nm约0.6的重组菌株以1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在30 ℃诱导12 h，破碎上清液重组单宁酶rCsTanA比活力为0.35 U/mg，镍柱纯化后的rCsTanA比活力为1.53 U/mg，纯化倍数约为4.4。纯化重组单宁酶rCsTanA分子质量为39 kDa，其最适温度和最适pH值分别为40 ℃和7.0。不同金属离子浓度对酶活力的影响存在差异，在低浓度（1 mmol/L）条件下，K＋增强了rCsTanA 37.28%的酶活力，而Ag＋、Cu2＋和Fe3＋使该酶活力均丧失80%以上；而在高浓度（5 mmol/L）条件下，Cu2＋表现出完全抑制rCsTanA活性的特性。表面活性剂（十二烷基硫酸钠、吐温80和十六烷基三甲基溴化铵）和极性溶剂（甲醇、乙醇、丙三醇、异丙醇及丙酮）对rCsTanA活性具有较强抑制作用。本研究不仅实现了茶树单宁酶的表达和酶学性表征，同时也丰富了单宁酶资源，为植物单宁酶的进一步应用研究提供了必要的理论支撑。     

牛凝乳酶原基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特性的研究

凝乳酶是制造干酪的关键酶。为获得高活性的牛凝乳酶(chymosin,B-chy),用电脉冲法将线性化的pGAPZαA-B-pchy重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中。该菌株在以葡萄糖为碳源的YPD培养基中可分泌表达牛凝乳酶原。SDS-PAGE分析表明所表达的牛凝乳酶,分子量约为37ku,符合预期大小。发酵培养96h后,酶活力达到96SU/mL。酶学特性分析表明,其最适凝乳温度为60℃,在pH2~6、小于50℃的温度范围内稳定。Ca2+浓度为40mmol/L时,钙促酶反应活性达到最高,此后随着Ca2+浓度的增加酶活力逐渐降低。金属离子Al3+、Mn2+、Fe2+、Mg2+和K+对酶活力具有显著的促进作用,而Co2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+对酶活力具有显著的抑制作用。本研究优化了凝乳酶的表达条件,为凝乳酶工业化生产提供了理论基础。     

金属离子对重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶可溶部分酶活力的影响

重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶可在重组菌BL21-pET22b-argE中高效表达,大多以不可溶的包涵体形式存在。文中研究了金属离子浓度及添加时间对该菌生长及可溶表达部分酶活力的影响。结果表明,1.0g/L的Mg2+对生物量和酶活有明显促进作用。Co2+的浓度及添加时间不同,对菌的生长及酶活力的影响结果也不同。培养起始加入Co2+会抑制菌的生长及酶活,而在1.0%乳糖诱导2.5h后加入则可解除生长抑制并促进酶活。Ni2+,Cu2+会抑制菌体的生长及酶活。Mn2+、Mo2+和B3+不影响菌的生长,对酶活有促进作用。添加金属离子后,酶活从16.90U/mL提高到251.91U/mL。     

金属离子对纳豆激酶的化学修饰研究

纳豆激酶(Nattokinase,简称NK)是一种新型食源性纤溶酶,具有很强的溶血栓作用。本项研究采用金属离子对纳豆激酶进行置换修饰研究,找出最佳金属离子的种类和浓度,提高酶活性,以更大的发挥其药理学功能。实验结果表明,修饰后纳豆激酶的酶活性及稳定性有明显的提高,6mmol/L的Mg2+对酶有明显的激活作用,比天然酶提高了45%的活性。Ca2+、Mn2+、Ni2+则表现出不同程度的抑制作用。因此,可通过加入Mg2+来改善提高纳豆激酶的活性。     

人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。     

重组1,3-丙二醇氧化还原酶酶学性质和稳定性的研究

1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是以甘油为底物生产1,3-PD途径中的关键酶之一。将dhaT在E.coliBL21(DE3)pLysS进行了表达,对含有6×His标记的PDOR进行了纯化,同时考察了重组PDOR的酶学性质和稳定性。重组PDOR反应的最适pH和温度分别是10.0和55°C;在pH7.0～8.0,酶保持了较高的稳定性,酶在30°C保温表现出较高的稳定性;Ca2+,Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用,而Fe2+,Na+,NH4+和Mn2+对酶活有促进作用;冷冻干燥处理后,PDOR酶活有一定的损失;添加适当浓度的保护剂——海藻糖、葡萄糖、蔗糖、聚乙二醇,对酶在冷冻干燥时有保护作用;添加5%蔗糖的固体酶制剂在保存过程中表现出较好的稳定性。     

蓝莓加工过程中出汁率及花青素的稳定性研究

研究果胶酶对蓝莓出汁率的影响,对果胶酶提高蓝莓出汁率的工艺条件进行优化,并研究了pH值、温度、光 照、金属离子以及部分添加剂对蓝莓果汁中花青素稳定性的影响。结果表明：果胶酶的最佳酶解条件为果胶酶添加量（质 量分数）0.06%、酶解温度35 ℃、酶解时间2 h。在此条件下蓝莓的出汁率可达到82.1%,与对照组相比,出汁率提高了 24.6%。蓝莓果汁中的花青素在pH≤3时比较稳定;对光和高温比较敏感。VC可以增加花青素的稳定性,而苯甲酸钠以及 蔗糖对花青素的稳定性无显著影响。K+、Na+、Ca2+、Cu2+、Fe2+对果汁中花青素的稳定性无显著影响;Fe3+以及浓度达到 0.1 mol/L的Mg2+对果汁中花青素的稳定性具有破坏作用;浓度低于0.05 mol/L的Mg2+能增加果汁中花青素的稳定性。     

不同金属离子对多酚氧化酶的影响

采用匀浆法从茄子中提取多酚氧化酶(PPO),以绿茶粉为底物,研究Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、Al3+和Fe3+7种金属离子对PPO活性的影响。结果表明:Cu2+、Mn2+和Mg2+3种金属离子对PPO的活性有不同程度的促进作用,而Ca2+、Na+、Al3+和Fe3+对PPO的活性有抑制作用。其中,Cu2+浓度为3mmol/L时对PPO有激活作用,此时茶黄素总量达到7.45mg;Fe3+浓度为5mmol/L对PPO有显著抑制作用,此时茶黄素总量降低至0.26mg。     

淫羊藿苷糖苷酶的纯化及其酶学性质的研究

对由菌株Absidiasp.E9r在发酵培养中产生的淫羊藿苷糖苷酶进行了分离纯化并对其酶性质进行了研究。结果表明,该酶的分子质量约为65ku,酶反应的最适温度和pH值分别为50℃和4.0,在20～60℃,pH3.0～6.0条件下稳定性较好;金属离子Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+对酶反应的影响不大,而Fe3+、Cu2+对其有很明显的抑制作用;酶反应动力学研究,Vmax=3.012mmol/(L.h),km=58.59mmol/L。     

杏鲍菇柄抗氧化肽的制备及其稳定性初步分析

为研究杏鲍菇柄抗氧化肽的制备及其稳定性,以杏鲍菇柄为原料,利用酶解法制备杏鲍菇柄抗氧化肽,采用单因素实验研究酶解时间、料液比、碱性蛋白酶加酶量,利用响应面分析法对杏鲍菇柄抗氧化肽的制备工艺进行优化。结果表明,碱性蛋白酶效果最好,最佳工艺条件为:酶解时间为1.59 h、液料比(mL/g)为16.06:1、碱性蛋白酶加酶量为5846 U/g,DPPH自由基清除率为55.52%±0.89%;研究表明杏鲍菇柄抗氧化肽在不同温度(20~100℃)、pH(2~12)、金属离子(K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+)、食品原料(5.0%的NaCl、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖)下表现的抗氧化活性不同。综上,该工艺能很好地制备杏鲍菇柄抗氧化肽,同时在储存过程中要尽量避免与高温、强酸强碱环境及金属离子等这些因素接触,本研究为杏鲍菇柄的进一步开发利用提供了理论基础。     

金属离子对蒜氨酸酶性质的影响

以新鲜大蒜为原料,采用硫酸铵分级沉淀法、PEG6000沉淀法、葡聚糖G-200柱层析法提取分离蒜氨酸酶,获得适宜蒜氨酸酶粗分离的条件为：4℃、pH6.5磷酸盐缓冲液浸提,20%的PGE6000盐析,2000×g离心30min。再采用SDS-PAGE电泳法鉴定其纯度,发现纯度是粗酶液的16.85倍,回收率为41.26%,蒜氨酸酶亚基的分子质量约为54.7kD。利用正交试验优化金属离子交互作用对蒜氨酸酶活性的影响,研究金属离子对蒜氨酸酶反应动力学及紫外-可见光谱的影响。结果表明：不同浓度的离子组合对蒜氨酸酶活性有显著的影响,Mn2+是影响蒜氨酸酶活性最重要的因素;不同离子交互作用最佳条件为：Mn2+ 浓度10mmol/L、Fe3+浓度10mmol/L、Ca2+浓度5mmol/L、辅助因子蔗糖浓度5mmol/L,此条件下蒜氨酸酶相对酶活性为155.59%。而10mmol/L的Cu2+能够显著抑制蒜氨酸酶的活性;以蒜氨酸为底物,测得蒜氨酸酶Km值为0.25mmol/L,Vmax为1.29μmol/min;紫外-可见光谱证实了辅基磷酸吡哆醛的存在,金属离子对蒜氨酸酶的激活与抑制机制可能是因为激活剂和抑制剂影响了蒜氨酸酶辅助因子5,-磷酸吡哆醛的结构以及其与蒜氨酸酶主链的结合,从而影响了蒜氨酸酶的活性。