AI-2的体外合成及其对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的影响

本文采用单因素实验,优化AI-2合成的孵育温度、pH、酶浓度以及孵育时间。利用优化的合成条件,成功合成具有生物活性的AI-2,活性约为阳性对照的2倍。添加合成的AI-2到MRS培养基中,研究AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391生长和细菌素合成的影响,并采用实时荧光定量PCR分析培养15 h的植物乳杆菌KLDS1.0391的细菌素结构基因pln EF的转录水平。结果表明:AI-2合成的最优条件为:0.5 mg/m L Pfs蛋白、1.0 mg/m L Lux S蛋白、2 mmol/L SAH,p H7.5,37℃孵育5 h。添加合成的AI-2对植物乳杆菌的生长无明显影响;培养3 h后,相同培养时间时添加AI-2的实验组对枯草芽孢杆菌ATCC6633的抑菌圈直径显著高于空白对照和阴性对照组(p0.01);添加AI-2的实验组的pln EF基因的表达量上调至空白对照的2.89倍。本研究成功优化AI-2的体外合成条件;添加合成的AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成有促进作用,且这种促进作用可能与pln EF基因转录水平上调有关。     

培养条件对副溶血性弧菌AI-2活性及其合成关键基因表达水平的影响

目的以海产品中分离的一株高产信号分子AI-2(Autoinducer-2)的副溶血性弧菌Vp2009027为研究对象,分析不同的培养条件(时间、温度、糖源、pH和盐度)对菌株AI-2活性及其合成关键基因表达水平的影响。方法采用报告菌株检测AI-2的活性变化,采用逆转录-实时荧光定量PCR法检测合成关键基因luxS和pfs表达量的变化。结果菌株培养12 h后AI-2活性达到最高,当培养温度为30℃时AI-2活性最高,添加糖源、中性和偏碱性环境以及适度的盐度均可促进AI-2活性的提高;不同培养条件下AI-2合成关键基因luxS和pfs的表达量均有不同程度的变化,温度和糖源对AI-2活性的影响与对luxS和pfs基因表达量的影响呈正相关,其他条件下AI-2的活性与luxS和pfs的表达量没有明显相关性。结论不同培养条件可以调控AI-2的合成,可以通过改变培养条件来获得不同产量的AI-2。     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

坚强肠球菌SQ-3-2基于Lux S群体感应系统信号分子AI-2的检测及方法优化

通过生物学方法检测坚强肠球菌SQ-3-2是否产生群体感应信号分子AI-2,并对检测条件进行优化。将坚强肠球菌SQ-3-2培养上清液加入到由哈维氏弧菌BB170构成的特异性报告系统中,使用多功能酶标仪化学发光模式检测荧光强度,通过与AB培养基空白对照进行荧光强度的比较得出坚强肠球菌SQ-3-2是否产生具有活性的AI-2信号分子,同时依据荧光强度的大小对加样比和酸碱度两个条件进行优化。研究结果表明,坚强肠球菌SQ-3-2培养上清液中含有AI-2信号分子,随着菌体密度的增加信号分子AI-2的浓度也随之增大,在对数期末期达到最大值。方法优化实验证明最佳检测条件为待测样品pH=7,加样比例为1∶100。实验为进一步研究坚强肠球菌SQ-3-2的Lux S系统打下基础。同时,方法优化实验为检测各类乳酸菌是否分泌AI-2信号分子提供了一定的实验基础和理论依据。     

食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立

针对食品中金黄色葡萄球菌检测,选取金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶标,利用地高辛标记引物扩增的PCR产物与生物素标记的探针杂交,然后与ELISA平板上的链霉素杂交,通过抗地高辛抗体显色建立PCR-ELISA检测技术。应用该方法检测人工污染牛奶中金黄色葡萄球菌,同时将大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌等常见食源性致病菌作为阴性对照。结果显示,金黄色葡萄球菌的纯培养物以及人工污染金黄色葡萄球菌牛奶,金黄色葡萄球菌为阳性,其他对照菌为阴性,两者PCR-ELISA检测敏感性均为10~1CFU/m L,比普通PCR检测的敏感性(10~3CFU/m L)高100倍。因此,该研究建立的PCR-ELISA方法具有良好的特异性与敏感性,能够特异、敏感、准确地检测牛奶中的金黄色葡萄球菌,为食品中金黄色葡萄菌的快速鉴定、风险评估与有效监测提供重要技术手段。     

一株乳酸菌细菌素的检测及其产生的最佳条件的研究

以一株分离自牙鲆肠道的乳酸菌L15为材料,用打孔法检测其发酵上清液对枯草杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用。排除有机酸和过氧化氢的干扰,证明上清液中含有抗菌的活性成分;用蛋白酶处理后,抑菌活性明显降低,表明起抑菌作用的是蛋白类物质的细菌素。研究表明,培养温度30℃、时间48h、pH值为7时是乳酸菌细菌素的最佳产生条件。对乳酸菌发酵上清液中的细菌素进行分离纯化,SDS-PAGE电泳表明乳酸菌的细菌素是一种具有抗菌活性的多肽,蛋白或蛋白复合物。     

外源诱导及共培养对植物乳杆菌J23合成细菌素Lac-B23的影响研究

目的 研究外源诱导物及共培养对植物乳杆菌J23合成细菌素Lac-B23的影响，为植物提高细菌素产量提供了有效的策略。方法 利用双层琼脂牛津杯扩散法测定细菌素活性，通过单因素实验、自诱导和共培养验证实验探究对细菌素J23产量的影响。结果 实验表明，当初始pH=7、温度37℃、培养时间16 h的条件下，细菌素Lac-B23的产量达到最大值。甘油和丙酮酸对细菌素Lac-B23的合成没有影响。酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸则能促进细菌素Lac-B23的产量。 此外，自我诱导研究发现植物乳杆菌B23发酵培养基中含有可以诱导细菌素Lac-B23合成的信号分子。植物乳杆菌J23与单增生李斯特菌或金黄色葡萄球菌共培养时可以提高细菌素Lac-B23的产量。然而，诱导菌的灭活菌体和无细胞上清液并不能提高细菌Lac-B23的产量。结论 环境诱导因素对细菌素的合成具有很大影响。初始pH、发酵温度、培养时间、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸可以作为诱导因子，提高细菌素Lac-B23的产量。细菌素Lac-B23合成的信号分子可能就是细菌素Lac-B23本身。 并且，共培养诱导分子没有分泌到培养基中，可能需要活的诱导细菌来诱导细菌素Lac-B22的合成。     

不同温度培养诱导金黄色葡萄球菌对超高压失活的抗性及其建模

探讨不同培养温度处理诱导金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)对超高压的抗性,并建立不同培养温度下金黄色葡萄球菌的超高压抗性模型。金黄色葡萄球菌经不同温度培养,在100~500 MPa的超高压条件下,选用线性、Weibull和Gompertz三种模型来拟合超高压抗性曲线,以决定系数(R2),均方误差(RMSE),精确因子(Af)和偏差因子(Bf)作为模型拟合度优劣的评判指标。实验结果表明,在100~500 MPa压力的作用下,线性模型的拟合效果不佳,R2最小值达到0.8870,Weibull和Gompertz模型对超高压的抗性具有较好的拟合性(R2≥0.9467),且Weibull模型的拟合效果最好,R2最大值达到0.9956,RMSE最小值为0.0312。因此,Weibull模型可以很好地拟合金黄色葡萄球菌以不同的培养温度胁迫后在超高压作用下的抗性曲线,随着培养温度的升高,金黄色葡萄球菌的超高压抗性呈增加趋势。     

金黄色葡萄球菌在酸奶中的生长状况与产毒规律研究

将酸奶发酵剂和不同菌数的金黄色葡萄球菌同时接种到原料乳中,检测酸奶发酵与冷藏过程中酸奶的pH值、乳酸含量、金黄色葡萄球菌菌数以及成品酸奶中金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的活性。结果表明,当原料乳中金黄色葡萄球菌初始接种量分别为1.8×10、1.8×102cfu/ml时,在酸奶发酵与冷藏过程中均未检测出金黄色葡萄球菌,成品酸奶中金黄色葡萄球菌耐热核酸酶活性呈阴性;当原料乳中金黄色葡萄球菌的接种量分别为8.5×103、2.7×104、2.7×105、1.8×106cfu/ml时,在酸奶发酵过程中(42℃、4～5h),金黄色葡萄球菌菌数呈明显上升趋势;在冷藏(4℃)过程中,金黄色葡萄球菌菌数呈逐渐下降趋势;对于原料乳中金黄色葡萄球菌初始接种量为8.5×103cfu/ml的样品,在冷藏的第3d就检测不出金黄色葡萄球菌,成品酸奶中耐热核酸酶活性呈阳性。在酸奶发酵与冷藏过程中同时伴随着乳酸含量的升高和pH值的降低。     

利用简并引物检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因

通过设计简并引物建立一种PCR技术同步快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A和B基因的方法。根据金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因编码序列,设计一对特异性简并引物SEAB来扩增靶基因片段,长度分别为105bp和135bp,通过对金黄色葡萄球菌肠毒素A、B菌株和4株对照菌株进行PCR检测,评价该引物的特异性;对金黄色葡萄球菌肠毒素B的DNA系列10倍稀释,对其灵敏性进行PCR检测。结果显示,金黄色葡萄球菌肠毒素A和B菌株的DNA检测结果呈阳性,4株对照菌株的检测结果呈阴性,通过基因测序证实了PCR产物的特异性,SEB的DNA最低检测浓度为3.58ng,整个检测过程不超过20h。建立了一个特异、快速灵敏的在同一条件下,金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因的PCR检测方法。     

乳酸乳球菌K6产Nisin Z的条件优化

本文以贻贝中筛选分离出来的乳酸乳球菌K6为研究对象,以细菌素抑制金黄色葡萄球菌的半抑制浓度(MIC50)为考察指标,优化乳酸乳球菌K6产乳酸链球菌素Z(Nisin Z)的条件。首先研究培养基、培养基初始pH值、菌液添加量、培养时间和温度5个因素对Nisin Z抑菌效果的影响,确定培养温度、培养时间和培养基初始pH值3个因素为显著因素,然后利用响应面法优化这3个因素。最终获得产Nisin Z的优化条件为:培养基初始pH 7.5,培养温度29.8℃,培养时间9 h。经过条件优化后,该细菌产细菌素抑菌浓度为0.625 BU/mL,较优化前细菌素浓度提高了8倍。优化后的细菌素对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。在最优条件下的试验结果与模型预测值接近,说明所建模型切实可行。     

实验用金黄色葡萄球菌生物被膜体外模型的建立

以96孔板为载体,通过改良微孔板法研究细菌接种浓度、培养基pH、培养基浓度、培养温度、培养时间5个单因素对金黄色葡萄球菌生物被膜生长量的影响。在单因素试验基础上,选择培养基pH、培养温度、培养时间3个因素,设计二次回归正交旋转组合试验,建立金黄色葡萄球菌生物被膜实验模型。结果表明,生物被膜成膜最佳条件为细菌接种浓度109CFU/mL、培养基pH7.3、培养基质量分数6%、培养温度37.5℃、培养时间为64.9h,此时96孔板所测光密度理论优化值为3.113 8。     

腐败牛奶中三种细菌生物被膜特性探究

生物被膜的形成给牛奶保藏和保鲜带来极大的隐患,探讨牛奶腐败过程中生物被膜形成特性以及寻求有效的抑制生物被膜的方法具有重要意义。本实验通过微孔板法模拟牛奶腐败过程,研究食源性金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和大肠杆菌在牛奶中生物被膜形成能力、生物被膜中活菌数目与种间群体感应信号分AI-2活力三者之间的关系。随后利用AI-2抑制剂呋喃酮,检测三种细菌生物被膜形成能力及AI-2活力变化。最后证明,三种细菌生物被膜形成能力、生物被膜中活菌数目以及AI-2活力顺序均是金黄色葡萄球菌大肠杆菌沙门氏菌。添加呋喃酮之后,三种细菌的生物被膜形成能力以及AI-2活力均下降,其中金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力下降为原来的25%。因此表明,此三种细菌生物被膜形成能力的大小可能是是通过调节生物被膜中AI-2的活力实现的。     

致病菌在四川泡菜发酵过程中生长规律的研究

通过在四川泡菜中分别接种志贺氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等致病菌,经过乳酸菌发酵,对3种致病菌在发酵期间的菌落数及pH值进行检测分析.结果表明:随着发酵时间的延长,pH值逐渐下降,3种致病菌生长均受到抑制,在pH值为3.4～3.6时,志贺氏菌不能存活,在pH值为3.56～3.7时,沙门氏菌不能存活,在pH值为3.6时,金黄色葡萄球菌仍然存在.故将金黄色葡萄球菌作为目标致病菌,根据金黄色葡萄球菌生理特性,进而从生产上控制和灭杀金黄色葡萄球菌.     

食品加工中的减菌处理对残存金黄色葡萄球菌生长的影响研究

为了解食品加工过程中的减菌处理对残存微生物生长的影响.本文以金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003为实验菌株,先将培养至对数期的菌液经过加热、冷冻、紫外线照射、次氯酸钠溶液浸泡、臭氧水浸泡处理后,接种至液体培养基中37℃下振荡培养12～14h,定时取样测定菌液浓度,Baranyi方程构建生长模型,根据生长迟滞期和最大比生长速率大小分析各种减菌处理方法对残存金黄色葡萄球菌生长的影响.结果表明,60℃加热5min和30mg/kg次氯酸钠溶液浸泡10min两种处理对金黄色葡萄球菌的生长迟滞期影响显著(p＜0.01),分别为3.95h和2.62h,约为对照的2.6和2.0倍.60‘℃加热5min和18W紫外照射15min两种处理对金黄色葡萄球菌的最大比生长速率影响显著(p＜0.01),分别为1.81log cfu/mL·h-1和1.831og cfu/mL· h-1,约为对照的1.1倍.0.5mg/kg臭氧水浸泡10min和-18℃冷冻3d两种处理对金黄色葡萄球菌的生长动力学参数影响不大.     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测食品中金黄色葡萄球菌的方法评价

目的 以传统国标培养法作为参比方法, 评价实时荧光核酸恒温扩增检测(real-time simultaneous amplification and testing, SAT)方法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力。方法 依据 GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对SAT法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力进行评价。分别检测纯培养物、人工污染样品以及实际样品来评价试剂盒的灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率和准确度, 同时采取2种方法的显著性差异分析, 确定最终结果。结果 SAT法灵敏度为100, 纯培养物检出限为103 CFU/mL, 人工污染检出限灵敏度为103 CFU/mL, 假阴性率为0、假阳性率为2.9%; 金黄色葡萄球菌的特异性符合要求。结论 SAT检测方法灵敏度高、特异性好, 假阳性率、假阴性率、准确度等检测结果全部达标, 并且检测时间短, 适用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测。     

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态的诱导和复苏

研究金黄色葡萄球菌活的非可培养状态(viable but non-culturable state,VBNC)的诱导和复苏方法。采用不同pH、温度、盐度、不同浓度的食品防腐剂山梨酸钾处理进行诱导;复苏则采用了直接升温处理、添加液体培养基升温处理、添加酵母液升温处理、添加吐温升温处理的方法。结果表明,经过不同温度和山梨酸钾诱导后的金黄色葡萄球菌进入了VBNC状态;其中诱导时间最短(76d)的条件是0.5mmol/L山梨酸钾、-20℃寡营养条件;采用BHI培养基升温的方法,以及添加0.5%和1%的吐温20和吐温80的培养液升温方法使进入VBNC状态的金黄色葡萄球菌得到复苏。VBNC状态的金黄色葡萄球菌在形态上发生了变化;复苏后的菌株除尿素酶阴性外,其他代谢特征均与标准菌株相同。     

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测

为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养（VBNC）状态的复苏问题,采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌,尝试四种复苏方法,并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明：8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌48 h后复苏,同时PMA-qPCR能够有效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌,克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。     

毕赤酵母重组菌高密度发酵产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL是一种热稳定、具有位置专一性等良好属性和应用前景的脂肪酶,已成功在多种宿主中实现重组表达。本研究构建含前导肽的TLL脂肪酶毕赤酵母重组工程菌,在摇瓶水平对该重组工程菌的培养和诱导条件进行优化,通过单因素试验,得到的最佳发酵条件:1.5%(体积分数)甲醇,pH 7.0,质量分数0.5%玉米油和0.1%阿拉伯胶,该条件下摇瓶发酵最高酶活为2 265.3 U/mL。以甲醇为唯一碳源进行高密度发酵,202 h后菌体OD600值达到最高282,对应发酵上清液的最高酶活为22 561.4 U/mL。参考摇瓶优化结果,采用辅助碳源与甲醇共诱导高密度发酵,培养和诱导208 h后,最终菌体OD600值达到362,对应发酵上清液的最高酶活为24 522.6 U/mL,较以甲醇为唯一碳源的对应值分别提高了28.37%和10.87%。另外,最高酶活较摇瓶水平发酵的最高酶活2 265.3 U/mL提高10.83倍,表明高密度发酵和共诱导是大幅提高酵母表达重组TLL蛋白的重要手段。     

应用干制培养基检测食品中金黄色葡萄球菌

目的建立金黄色葡萄球菌X干制培养基(Staphylococcus aureus X medium, XSA)检测食品中金黄色葡萄球菌的分析方法。方法依据GB 4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》中前处理的方法制备样品,将样品添加到7.5%NaCl肉汤增菌后接种至干制培养基XSA上进行培养,通过鉴定实验进行定性检测和菌落平板计数进行定量检测,并用国标法同时进行定性及定量检测。结果在定性检测方面,该方法和国标方法假阴性率和假阳性率均为0%,但是检测时间由92 h缩短为48 h,在定量检测方面,该方法与国标法的对数偏差值的绝对值为0.3979<0.45,并且在6次检测同一个样品时的结果相对标准偏差较小,从而说明该方法和国标法的准确度相当,检测时长由78h缩短至24h,大大提高了检验效率。结论该方法操作简便快捷,结果稳定,适用于食品中金黄色葡萄球菌的检测。