花椒果皮基因组DNA提取: 不同试剂盒性能评估与比较研究

摘 要: 目的 通过比较不同植物试剂盒在花椒果皮DNA提取中的差异, 探究适用于花椒果皮的基于离心柱法的DNA提取试剂盒。方法 选取8种不同品种的花椒, 利用TIANGEN DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen-Ⅰ)、DNeasy Plant Mini Kit (DNeasy)、多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen-Ⅱ)、Nucleospin ? Food kit (Nucleospin) 4种基于离心柱法的试剂盒提取花椒果皮基因组DNA, 通过对比提取到的DNA浓度、纯度、聚合酶链式反应扩增能力, 以及提取过程中的成本、耗时等因素, 基于简单加权(simple additive weighting, SAW)分析对比不同试剂盒对于花椒果皮DNA的提取的效果, 并进行综合评分。结果 不同试剂盒各有优缺点, 最终Tiangen-Ⅰ试剂盒得分1.64, 排名第一, 综合考虑价格、所用时间与提取得到的DNA质量, Tiangen-Ⅰ试剂盒是更适用于花椒果皮DNA提取的试剂盒; 同时, Nucleospin试剂盒在提取得到的花椒DNA质量方面有着较好的表现。结论 本研究以花椒为例探究干扰组分较多植物的基因组DNA试剂盒提取方案, 通过比较Tiangen-Ⅰ试剂盒被推荐作为最佳选择, 本研究为花椒果皮及其他相似植物的基因组DNA提取提供了参考方案。     

几种食用植物油DNA提取方法效果比较

本文主要研究高效简便的食用植物油DNA提取方法,为食用植物油后续核酸检测实验奠定基础。本次实验选取11份不同原料市售食用植物油为实验样品,进行核酸富集处理,采用CTAB法和三种不同试剂盒法对富集前后样品进行DNA提取,用植物叶绿体t RNA基因扩增结果评估DNA提取效率。最后得出,结合核酸富集与CTAB法、DNeasy?Plant试剂盒提取食用油DNA,可应用于后续植物油基因检测和成分鉴定。     

骨胶原蛋白肽粉中DNA的提取及猪、羊源性成分的检测

目的 优化深加工骨胶原蛋白肽粉中DNA的提取方法, 鉴定检测其动物源性成分。方法 采用2种试剂盒法, 并对试剂盒部分步骤进行适度修改后提取骨胶原蛋白肽粉中的基因组DNA, 分别用猪、羊引物和探针对提取的DNA片段进行实时荧光PCR扩增检测。结果 只有DNeasy Blood & Tissue Kit提取试剂盒法提取的DNA纯度较好, A260/A280比值为1.73, 浓度为8.2 ng/μL, 并且经18S rDNA片段的PCR扩增结果表明样品中含有哺乳动物DNA, 且DNA中不含抑制PCR反应物质。检测结果表明该骨胶原蛋白肽粉中含有猪源性成分。 结论 采用试剂盒法提取深加工骨胶原蛋白肽粉中DNA时, 需对部分步骤做修改后才可进行。     

浆果基因组DNA提取方法比较及PCR优化

为获取高质量的浆果基因组DNA,以8种浆果果实为样品,采用Macherey-Nagel Nucleo SpinR食品基因组提取试剂盒、Qiagen DNeasyR植物基因组提取试剂盒、TIANGEN植物基因组提取试剂盒、Promega WizardR食品基因组提取试剂盒、Biotecon FoodproofR转基因样品纯化试剂盒及Magen Hi Pure食品基因组提取试剂盒6种试剂盒进行DNA提取效果的比较分析。结果显示,Macherey-Nagel Nucleo SpinR食品基因组提取试剂盒、TIANGEN植物基因组提取试剂盒和Magen Hi Pure食品基因组提取试剂盒所得DNA质量较差,DNA严重降解和污染;Qiagen DNeasyR植物基因组提取试剂盒法、Promega WizardR食品基因组提取试剂盒法和Biotecon FoodproofR转基因样品纯化试剂盒均能得到质量较好的DNA,而Promega WizardR食品基因组提取试剂盒法和Biotecon FoodproofR转基因样品纯化试剂盒的DNA完整性低,扩增效率低于Qiagen DNeasyR植物基因组提取试剂盒提取的DNA。最终,以Qiagen DNeasyR植物基因组提取试剂盒作为浆果分子检测中模板DNA提取的通用性方法。     

食用植物油DNA提取方法的优化

目的建立可从不同种类食用植物油中提取得到高质量的、可用于分子生物学检测的DNA的提取方法。方法使用2种改进十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)和2种商用试剂盒提取6种食用植物油的DNA,通过紫外分光光度计检测所得DNA样品的浓度和纯度。设计特异性引物,并通过普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测DNA样品是否可用于分子生物学分析。结果使用改良CTAB法1及2种商业试剂盒无法有效提取得到的6种食用植物油的DNA,样品无法满足分子生物学检测的需要,使用改良CTAB法2提取得到的6种食用植物油DNA纯度和浓度检测结果均为最佳,其提取的橄榄油、菜籽油、花生油DNA样品可用于后续实时荧光定量PCR检测。结论该方法可为橄榄油、菜籽油、花生油DNA提取提供有效手段,为食用植物油检测和研究奠定基础。     

4种方法提取牛肉干DNA的效果比较

目的探求熟肉干制品最佳的DNA提取方案。方法采用4种不同的方法:CTAB法及3种市售试剂盒法,提取11种不同牛肉干样品的DNA,通过对方法的提取耗时,提取DNA的质量及提取DNA用于实时荧光PCR扩增的效果3方面进行比较。结果 TAKARA试剂盒法提取DNA耗时最短仅需要0.5 h,OMEGA试剂盒法提取的DNA的纯度较好,A 260/A 280比值最接近1.8,Tiangen的深加工食品DNA提取试剂盒法提取的DNA做实时荧光PCR的CT值最小,扩增效果最佳。结论 Tiangen试剂盒法对于熟肉干制品DNA的提取效果更为理想。     

石斛基因组DNA提取方法比较研究

目的：比较3种基因组DNA提取试剂盒对提取富含多糖多酚类物质的铁皮石斛和霍山石斛鲜叶及冻叶的提取效果。方法：对提取的DNA进行纯度及产率检测、电泳质量分析及ITS2 PCR扩增效率检测。结果：市售基于蛋白酶K消化法的试剂盒不适用于石斛DNA提取；基于改良CTAB法的试剂盒更适用于需要较高DNA模板量的石斛鲜叶的DNA提取；基于改良SDS法的试剂盒更适用于石斛冻叶的DNA提取，该法提取的鲜叶DNA完整性最佳，更适用于对DNA完整度要求较高的DNA大片段的分析研究。结论：基于改良CTAB法和改良SDS法的试剂盒提取的石斛鲜叶及冻叶的基因组DNA均适用于常规分子检测。     

用于转基因检测的番木瓜基因组DNA提取方法的比较

本研究以番木瓜果实的不同部位,果皮、果肉和种籽为材料,比较了改进CTAB法和试剂盒法两种提取基因组DNA的方法。分别对植物叶绿体基因rbcL和番木瓜特异基因Papain进行了普通PCR和荧光PCR扩增,检验提取DNA的质量。结果显示改进CTAB法和试剂盒法都能提取得到纯度较高的DNA,适合普通和荧光PCR反应的要求,适用于外源基因的检测。改进CTAB法提取的DNA浓度要高于试剂盒法,而试剂盒法提取DNA所用的时间较短,更为方便,但成本较高。同时材料取样部位最好是果皮和果肉,果皮和果肉为材料提取得到的DNA纯度很高,适用于荧光PCR的要求。     

几种提取转基因木瓜DNA的方法比较

目的 比较CTAB法、SDS法及试剂盒法分别提取木瓜果皮、果肉、种籽DNA的效果, 以提高转基因木瓜的检测准确率。方法 对转基因木瓜内源基因Papain及外源基因NPTII、CP进行普通PCR, 同时对基因表达零件CaMV35S启动子和NOS终止子进行荧光PCR, 以检测提取DNA的质量。结果 分析电泳产物发现, SDS法提取木瓜种籽样品的DNA未能适合普通PCR检测的要求, 其他方法均能满足普通PCR要求。荧光PCR结果显示, 3种方法提取的DNA都满足荧光扩增要求。结论 比较3种提取方法及3种木瓜材料, 发现用CTAB法或SDS法以果皮为材料提取DNA质量最佳。     

果汁DNA提取方法比较及柑橘属植物分子生物学检测技术的研究

以橙汁为研究对象,选取市售100%橙汁及橙汁饮料各3种,采用CTAB法、SDS-CTAB法以及改良CTAB法提取其DNA,对所提取的DNA的浓度、纯度及扩增效率进行比较;同时选取橙UDP-葡糖基转移酶蛋白基因设计柑橘属植物特异性扩增引物,通过定性PCR检测其特异性和灵敏度,并应用于果汁中柑橘属植物的检测。实验结果证明,由改良CTAB法获得的DNA模板质量较高,适用于果汁中DNA的提取。UGT基因引物可对柑橘属植物产生特异性扩增,最低检测限为10pg/μL。将该引用物用于市售橙汁的检测,其检测结果为阳性,从而证明UGT基因特异性引物可用于果汁中的柑橘属植物成分的检测及鉴伪研究。     

Detection of recombinant DNA from genetically modified papaya

A method using polymerase chain reaction (PCR) was developed to detect the genetically modified (GM) papaya (55-1 line), of which the mandatory safety assessment has not been finished in Japan because of insufficient data. The papaya intrinsic papain gene was used as an internal control. The results of PCR amplification of the papain gene segment indicated that a commercial silica membrane type kit (QIAGEN DNeasy plant mini) was useful for extraction of DNA from papaya fruit, but not for extraction from canned papaya fruit. On the other hand, a commercial ion-exchange type kit (QIAGEN Genomic-tip) provided enough purified DNA for PCR from canned papaya fruit. Compared with the parental line and other commercial non-GM papayas, the DNA from GM papaya fruit provided specific amplification bands in PCR with five primer pairs (Nos. 2-6) including beta-glucuronidase and neomycin phosphotransferase II gene-specific ones. On the other hand, the primer pairs recognizing these genes showed false-positive results when we used DNAs from canned papaya. Therefore, we recommend that the primer pairs (Nos. 5 and 6) recognizing the sequences derived from two different species of organism should be used in order to detect specifically the GM papaya in canned fruits.     

食品检测用4种病原菌基因组试剂盒提取方法的比较与优化

目的:采用国产的天根细菌基因组提取试剂盒,制备具有自主知识产权的、达到国家核酸标准物质要求的食源性病原菌的基因组样品。方法:以4种食源性病原菌大肠埃希氏菌O157:H7、单增李斯特氏菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为研究对象,首先使用进口OMEGA细菌基因组提取试剂盒和国产天根细菌基因组提取试剂盒提取4种病原菌的基因组,然后对国产试剂盒提取的基因组浓度和纯度较低的大肠埃希氏菌O157:H7、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的基因组提取方法进行优化。最后对4种病原菌基因组的完整性和纯度进行琼脂糖凝胶电泳检测,并分别对4种病原菌的特征毒力基因进行PCR扩增验证。结果:通过方法优化,使用国产天根细菌基因组提取试剂盒提取的4种病原菌的基因组质量浓度均在50 ng/μL以上,A260/A280和A260/A230的值在1.7~2.0之间,基因组DNA条带完整,无RNA和蛋白污染,各菌株的特征毒力基因均为阳性。结论:通过基因组提取方法的优化,得到符合国家核酸标准样品要求的4种病原菌基因组样品,为后续大量制备核酸标准样品奠定了基础。     

Comparison of four commercial DNA extraction kits for PCR detection of Listeria monocytogenes, Salmonella, Escherichia coli O157:H7, and Staphylococcus aureus in fresh, minimally processed vegetables

Four commercial DNA extraction methods, PrepMan Ultra (Applied Biosystems), InstaGene Matrix (BioRad), DNeasy Tissue kit (Qiagen), and UltraClean (MoBio), were tested for PCR detection of Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157: H7, Salmonella, and Staphylococcus aureus in fresh, minimally processed vegetables. For comparative purposes, sensitivity assays with specific PCRs were carried out after DNA extraction with the four methods in green pepper, broccoli, and onion artificially inoculated with the four pathogens separately. As confirmed by statistical analysis, the DNeasy Tissue kit rendered the highest sensitivity values in the three matrices assayed for Salmonella, L. monocytogenes, and E. coli O157:H7 and in onion for S. aureus. Despite being the most expensive of the methods compared, the DNeasy Tissue Kit can be successfully applied for any of the four most commonly studied pathogens, thus saving time and overall reducing the cost of the analysis.     

基于简单加权分析的花椒果皮DNA快速提取方法比较研究

目的 开发和探究适用于花椒基因组DNA的快速提取方法。方法 选取8种不同品种的花椒, 分别利用3种不同的DNA提取方法, 包括一管式植物DNA抽提试剂盒、基于载体的纤维素滤纸提取法和无菌拭子浸入法, 进行花椒果皮基因组DNA快速提取, 比较不同DNA提取方法在花椒果皮基因组提取中的效果。其中纤维素滤纸提取法和无菌拭子浸入法均通过载体转移进行DNA的快速提取, 基于十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)两种不同的裂解液, 在3 min以内即可提取DNA并得到聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增体系。通过简单加权(simple additive weighting, SAW)分析, 基于PCR扩增能力、提取时间、提取成本、试剂安全性、程序简单性等方面进行综合评分。结果 所选的快速提取试剂盒不适用于花椒果皮这类含次生代谢物较多的实验材料, 而无菌拭子、纤维素滤纸两种载体提取得到的花椒果皮DNA均可以进行后续的PCR操作, 最终CTAB纤维素滤纸法以其低成本、短时间、高扩增效率等优势排名第一。结论 本研究探究了适用于花椒果皮基因组DNA的快速提取方法, 并且通过SAW分析得出CTAB纤维素滤纸法是最优选择, 表明载体转移法可以作为花椒基因组DNA快速提取方法之一, 为花椒基因组DNA快速提取提供了参考方案, 并为类似动植物基因组DNA的快速提取研究提供了参考。     

鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法的建立及优化

目的 建立及优化鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法。方法 本研究比较了植物 DNA 快速提取试剂盒法、棉签法、纤维素膜片法和滤纸片法 4 种方法提取 15 种鲜榨果汁基因组 DNA 的效果，并筛选不同的提取液和裂解液、优化裂解液中的盐酸胍浓度和果汁基因组提取时间。结果 滤纸片法采用DNA裂解液（6 mol/L盐酸胍、1%聚乙烯吡咯烷酮、50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20 mmol/L乙二胺四乙酸、21.3 mmol/L曲拉通-X-100；pH 6.4）、DNA漂洗液1（8 mol/L盐酸胍、50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；pH 6.4）和DNA漂洗液2（10 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100 mmol/L氯化钠；pH 8）即可在 5 min 内从鲜榨果汁中提取得到适用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的基因组 DNA。结论 本研究建立的滤纸片法不需要离心机等昂贵的仪器设备、操作简单、无刺激性气味、无环境条件限制，具有快速、价廉、环保等优点，为果汁基因组 DNA 快速提取与现场鉴定研究提供了参考。     

食品中甲型肝炎病毒RNA提取方法的比较及应用

目的：对食品中甲型肝炎病毒的3 种RNA提取方法进行综合比较,以优选出最佳的核酸提取方法,为各级实验室开展食源性甲型肝炎病毒核酸检验提供技术参考。方法：分别采用ABI AM1836、QIAGEN 74104和 ROCHE11858882001三种商业化核酸提取试剂盒对人工污染甲型肝炎病毒的食品样品进行核酸提取,根据3 种核酸提取方法的提取效率、抑制剂去除效率、检测灵敏度、综合应用指标进行病毒RNA的优化,且采用优化后的提取方法进行实际样品的检测。结果：综合病毒各项评价指标显示,ROCHE 11858882001在食品中提取甲型肝炎病毒RNA效果最优,其次为QIAGEN 74104和ABI AM1836。101 份样品的检测结果显示,一份蓝靛果样品为甲型肝炎病毒核酸阳性,其余样品均为阴性。结论：ROCHE 11858882001是一种快捷有效的病毒RNA提取方法,适用于食品中甲型肝炎病毒的日常检测工作。     

PCR法检测大豆加工食品中的转基因成分

通过分子生物学手段,以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,建立了检测大豆加工食品中转基因成分的方法。实验分别采用CTAB法和试剂盒(Kit)法对大豆锅巴、豆浆、豆奶粉、豆腐、豆腐丝等五种大豆加工食品中的DNA进行了提取,用内标基因Lectin对此两种方法的提取效果进行了比较,并以提取的DNA为模板,利用不同的引物分别对目标基因35S和NOS进行了PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明:Kit法的DNA提取效果优于改良CTAB法,上述五种大豆加工食品中均检测出35S启动子和NOS终止子,且均含有转基因成分。