外源dsRNA介导的RNAi对烟草CMV侵染的抑制作用

为研究外源dsRNA介导的RNA干扰（RNA interference, RNAi）对烟草黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）侵染的抑制作用,选择与病毒在寄主体内胞间移动和长距离运输密切相关的移动蛋白（Movement protein, MP）基因为靶标,通过克隆CMV MP基因,结合序列分析评估设计dsRNA,以体外合成的方式制备了MP基因中一段490 bp的dsRNA。通过与CMV共接种,结合MP基因表达水平和病毒发病症状,综合评价MP dsRNA对CMV的抑制效果。结果表明,外源喷施的MP dsRNA显著降低了染病烟株中CMV基因的表达水平,有效抑制了病毒的侵染和危害,具有烟草CMV生物防治的应用潜力。     

RNAi技术在药物研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是生物界中一种既古老且在进化上又高度保守的现象,是基因转录后沉默的重要机制之一。它主要通过双链RNA(dsRNA)被核酸酶切割成21-25nt的小RNA(siRNA)发挥作用,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现,需要有多种蛋白因子以及ATP参与,而且具有生物催化反应特征。RNAi是新发现的一种通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径,在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中具有广阔的应用前景。现将近年RNAi的研究进展作一综述。     

Dicer 在 RNA 沉默中的作用

RNA沉默是一种在真核生物中广泛存在的防御机制,它的一个主要作用是抗病毒。为了阐明这个机制,很多植物病毒的功能蛋白都被用来做RNA沉默抑制子的研究。RNA III聚合酶家族的Dicer在基因沉默机制中发挥关键的作用,不同的物种含有不同数量和种类的Dicer,可以将外源的mRNA切割成21-26nt的小片段,从而阻断外源基因的翻译途径,达到基因沉默的目的。病原物在进化的过程中,编码沉默抑制子蛋白,对抗寄主的基因沉默。沉默抑制子通过与寄主的蛋白或外源RNA等互作,抑制寄主的基因沉默。关于Dicer与沉默抑制子的研究将给更好地解析基因沉默机制提供理论基础。     

Dicer在RNA沉默中的作用

RNA沉默是一种在真核生物中广泛存在的防御机制，它的一个主要作用是抗病毒。为了阐明这个机制，很多植物病毒的功能蛋白都被用来做RNA沉默抑制子的研究。RNA III聚合酶家族的Dicer在基因沉默机制中发挥关键的作用，不同的物种含有不同数量和种类的Dicer，可以将外源的mRNA切割成21-26nt的小片段，从而阻断外源基因的翻译途径，达到基因沉默的目的。病原物在进化的过程中，编码沉默抑制子蛋白，对抗寄主的基因沉默。沉默抑制子通过与寄主的蛋白或外源RNA等互作，抑制寄主的基因沉默。关于Dicer与沉默抑制子的研究将给更好地解析基因沉默机制提供理论基础。     

甘蓝型油菜Bnl9070的表达与同源基因At2g19070的amiRNAi研究

基于原芯片杂交结果,油菜杂合双显性雄性核不育系差异表达基因Bnl9070与拟南芥At2g19070基因高度同源,在油菜可育株雄蕊中高量表达,不育株雄蕊中表达量极低。从雄性不育基因At2g19070入手,利用amiR—NAi（人工微RNA干扰）技术对其两个RNA区段分别设计靶标,转化拟南芥。在多个转基因拟南芥植株和后代中普遍观察到小孢子数量减少、成熟花粉萎缩失去活力、不结实或者少结实的不育表型。两个靶标的干扰使转基因拟南芥出现了类似的表型,基因表达抑制率都在90％以上,干扰效果好,暗示amiRNAi技术在靶标选择上具有一定的灵活性。At2g19070基因的干扰对Bnl9070的功能研究有借鉴作用。     

PVY、CMV双价抗性RNA沉默表达载体的构建

采用RT-PCR方法克隆了PVYCP基因、PVYHC-Pro基因、CMVCP基因和CMV2b基因的保守片段,分别将PVYCP片段和CMV2b片段、PVYHC-Pro片段和CMV2b片段、PVYHC-Pro片段和CMVCP片段连接起来,以此为靶标构建并得到3个RNA沉默表达载体pCAMPb、pCAMHb和pCAMHP。获得的载体可以应用于植物转基因抗病毒育种工程中。     

含4 种食源性病毒检测靶标多联装甲RNA的制备、纯化与定值

基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台构建同时含有诺如病毒（norovirus,NoV）、甲肝病毒（hepatitis A virus,HAV）、轮状病毒（rotavirus,RV）、星状病毒（astrovirus,AstV）检测靶标RNA的多联装甲RNA（multiplex armored RNA,AR-MulV）,并进行纯化与初步定值。结果表明,重组质粒在大肠杆菌中成功表达,表达产物大小约为14.1 kDa;制备的AR-MulV经纯化后无杂蛋白与残留重组质粒,电镜下可见大量结构形态完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm。初步定值结果显示,AR-MulV中GI型NoV、GII型NoV、HAV、RV和AstV检测靶标RNA的含量分别为（1.24±0.2）×107、（2.54±0.6）×107、（2.24±0.3）×107、（2.96±0.5）×107 copies/μL和（3.19±0.4）×107 copies/μL。本研究基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台成功制备同时包含4 种食源性病毒标准方法检测靶标的多联装甲RNA,为食源性病毒的分子检测以及多重实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应阳性质控样品的研发提供新思路。     

代谢改造黑曲霉合成乙酰氨基葡萄糖

该研究以黑曲霉为底盘细胞,首先敲除N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine,GlcNAc）摄取相关转运蛋白ngtA编码基因,获得GlcNAc的吸收利用缺陷型菌株,有利于胞外GlcNAc的积累。在此基础上,通过表达大肠杆菌来源的卤酸脱卤酶样磷酸酶编码基因yqaB,构建黑曲霉GlcNAc的完整合成途径,实现GlcNAc的合成,产量为1.78 g/L。通过共过表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因gnaA和氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因gfaA强化GlcNAc合成途径,GlcNAc的合成水平提升至3.64 g/L。为增加GlcNAc合成前体GlcNAc6P的胞内供给,利用RNA干扰技术对乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸（GlcNAc6P）分解代谢途径中氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨基酶基因nagB和乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA基因表达进行弱化表达,GlcNAc产量进一步提高至4.03 g/L。为减弱黑曲霉糖酵解途径与GlcNAc合成途径竞争共同前体物质果糖-6-磷酸,对磷酸果糖激酶基因pfkA进行弱化表达,GlcNAc的最终产量为4.61 g/L。     

TcYellow-h基因过表达参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性形成

本研究以赤拟谷盗（Tribolium castaneum）为研究对象,旨在明确表皮相关基因TcYellow-h在害虫磷化氢抗性形成过程中的作用。序列分析结果表明TcYellow-h编码468个氨基酸,其拥有一段保守的MRJP（major royal jelly protein）特征序列;RT-qPCR结果显示,TcYellow-h在赤拟谷盗外周组织器官（头、胸、腹的表皮、翅和足）中表达水平较高,在内部器官（脂肪体、肠道、马氏管）中的表达量相对较低;此外,在不同地理种群中,TcYellow-h的表达量随磷化氢抗性水平的增加呈上升趋势;注射dsRNA能有效抑制TcYellow-h基因的表达,沉默效率为73.0%;干扰抗性种群（GD）TcYellow-h基因的表达后再用LC30的磷化氢处理试虫,赤拟谷盗的死亡率显著上升至64.4%。本研究初步证实赤拟谷盗表皮相关基因Yellow-h的过表达与磷化氢的抗性形成相关。     

果蔬低温贮藏的糖代谢转录调控研究进展

低温贮藏是延缓果蔬采后品质劣变的主要手段。该文通过综述低温延缓果蔬贮藏品质劣变的生理生化作用，总结果蔬低温贮藏糖代谢研究进展，阐明果蔬糖代谢的转录调控作用。此外，对低温延缓果蔬采后品质劣变与v-myb禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）转录调控糖代谢的关系研究进展进行综述，以期揭示果蔬采后低温贮藏过程中糖代谢的可能转录调控机制，为果蔬贮藏保鲜和加工提供理论依据。