一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC—SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC—SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导,表达产物进行Ni^2＋-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a—EC—SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E．coli BL21（DE3）后,重组蛋白获得表达,Ni^2＋-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85％以上,经噻唑蓝（MTT）法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC—SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC—SOD3．凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

蜂毒肽与死亡素杂合肽(MT)在大肠杆菌中融合表达的研究

人工合成的蜂毒肽与死亡素的杂舍肽DNA序列，经聚合酶链式反应（PCR）扩增后得到带有BamHI和XhoI限制性酶切位点的序列．将此基因克隆至载体pET-32a，成功构建了重组质粒pET32a—MT．测序验证后转化大肠杆菌BL21（DE3），37℃IPTG诱导，获得高效表达，融合蛋白经Ni柱亲和纯化后用肠激酶切下杂合肽，杯碟法检验酶切产物具有抑菌活性。     

绿色荧光蛋白的原核表达、纯化与荧光分析

将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入到pET30（a）＋构建pET30-GFP表达载体，将重组载体导入大肠杆菌BL-21中，经IPTG诱导产生His—GFP融合蛋白，融合蛋白主要存在于可溶性上清中。用镍柱亲合纯化His—GFP，分子量大约为32．4kD，与预期值相符。荧光分析表明，His—GFP与野生型GFP荧光激发及发射波长基本相同，荧光性质稳定，比常用的荧光素（FITC）具有更强的抗荧光淬灭能力。通过此方法制备的绿色荧光蛋白可用于食用色素的开发等。     

草鱼潜在过敏原α-烯醇化酶原核表达条件的优化

目的 通过对草鱼α-烯醇化酶(α-Enolase)原核表达的条件进行优化,分别从表达的上清液与包涵体中纯化获得重组α-Enolase。方法 本研究基于前期克隆的草鱼α-Enolase基因序列设计表达引物,将草鱼α-Enolase基因克隆至pET-30a质粒中,得到pET-30a-α-Enolase重组质粒。然后,将重组质粒转入大肠杆菌Origami 2(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside, IPTG)进行体外诱导表达。采用SDS-PAGE电泳方法分析重组蛋白的可溶性,并对表达条件进行优化.。利用亲合层析法纯化目的蛋白。结果 在20℃诱导15 h得到的重组蛋白以二种形式存在：一部分为可溶性蛋白存在于上清液中,一部分以包涵体形式存在于沉淀中;在37℃诱导4 h得到的重组蛋白则只有包涵体形式。包涵体蛋白表达量最大的优化条件为：诱导温度为37℃,IPTG终浓度1.0 mmol/L,诱导时间4 h时。采用亲合层析法分别纯化上清液(20℃诱导15 h)和包涵体中(37℃诱导4 h)的重组蛋白,得率分别为3.5 mg /100 mL和4.9 mg/100 mL菌液。结论 利用原核表达从上清液与包涵体中均可纯化得到重组α-Enolase。但这二种α-Enolase在生物活性与免疫原性是否存在差异性,以及通过重组α-Enolase是否可以代替天然蛋白用于鱼类过敏原的研究,有待进一步研究。     

花生过敏原Ara h2.02原核表达方法条件的研究

将重组质粒pET-32a(+)-Arah2.02转化表达宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白大小约为38kDa。进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Arah2.02。为获得较多的重组蛋白Arah2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速220r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK原核表达、纯化及溶液构象分析

金黄色葡萄球菌K型肠毒素（Staphylococcus aureus enterotoxin K,SEK）由金黄色葡萄球菌肠毒素基因簇编码,流行病学显示,编码SEK蛋白的sek基因在食品源金黄色葡萄球菌菌株中具有较高的检出率,说明SEK也可能是一种重要的食品中毒潜在致病因子。本研究将截去N端信号肽的SEK蛋白编码基因与原核表达载体pET-28a（＋）连接,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-ΔNspsek;通过对sek基因在不同原核表达宿主菌中的表达及表达条件优化分析,确立SEK蛋白的最优表达条件;利用镍亲合层析纯化含组氨酸（His）标签的SEK融合蛋白,将凝血酶切除His标签后的SEK蛋白进行聚合状态及热稳定分析、荧光发射谱和圆二色谱分析。结果表明,重组蛋白SEK表达成功,热处理导致蛋白部分降解;荧光光谱揭示SEK蛋白在278?nm和295?nm波长处具有相同的最大色氨酸发射峰;344?nm波长处表明SEK蛋白处于紧密折叠的天然状态;圆二色谱分析表明,ΔNspSEK重组蛋白富含β-折叠（23.6%）、β-转角（28%）以及α-螺旋（29.1%）等二级结构。为深入研究SEK蛋白的结构与功能提供基础,也对改进食品加工工艺和提高食品安全具有指导意义。     

植物乳杆菌NP_785232蛋白N端两个特定结构域在大肠杆菌中的诱导表达

以植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232为研究对象,采用外源重组表达的方法大量制备其前两个结构域。应用聚合酶链式反应方法克隆NP_785232蛋白N端的前两个结构域,将克隆获得的片段连入表达载体pET30a中构建重组质粒pET30a/N2,该重组质粒转化大肠杆菌后,用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷诱导重组菌,重组蛋白经HisTrap柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对电泳获得的目的大小的片段进行质谱鉴定。结果表明：获得的重组蛋白与NP_785232蛋白N端的前两个结构域完全相同。通过大肠杆菌表达系统可以有效表达植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232 N端的前两个结构域。     

芹菜过敏原蛋白Api g1.02的克隆、表达及单抗制备

提取芹菜总RNA,反转录PCR(RT-PCR)扩增出过敏原蛋白Apig1.02基因,经PCR、酶切和序列测定后,得到重组质粒pET-32a-Apig1.02。将重组质粒转化到BL21(DE3)pLys感受态细胞中,用1mmol/L异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)对转化菌进行诱导表达及SDS-PAGE分析后,将表达蛋白提取纯化,制备单克隆抗体并进行Western blot分析。结果表明芹菜过敏原蛋白Apig1.02在体外获得了高效表达,表达融合蛋白分子质量约35ku,诱导6h后表达量最高,占菌体总蛋白的40%左右;制备的单克隆抗体能与表达蛋白发生免疫印迹反应,说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。该研究结果为建立芹菜过敏原蛋白的免疫学检测方法奠定了基础。     

花生致敏原Ara h 1的重组表达与纯化

Ara h 1是花生中含量最高的过敏原,也是致敏性较高的蛋白之一。目前提纯Ara h 1的方法大多涉及2至3步柱层析,步骤繁琐且成本较高。本文中,将带有6×his标签的Ara h 1基因与pET-32a表达载体融合,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS,诱导使其表达目标蛋白。菌体裂解后使用Ni-NTA吸附、梯度洗脱对Ara h 1进行纯化。采用质谱及Western-blot鉴定纯化蛋白的种类及免疫活性。结果显示,质粒中目标基因的序列与NCBI数据库中Ara h 1的基因数据相符;300 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷22℃诱导菌液22 h时蛋白表达量最高;添加15 mmol/L十二烷基磺酸钠可将蛋白释放到上清液中,使用含50,100mmol/L咪唑的洗脱液分别洗脱2次和1次后得到纯度较高且免疫原性良好的重组Ara h 1。     

小龙虾主要过敏原精氨酸激酶的表达、纯化及 免疫原性鉴定

目的对纯化后的原核表达小龙虾主要过敏原蛋白精氨酸激酶进行免疫学鉴定。方法将化学合成的精氨酸激酶基因克隆至pET-28a(+)表达质粒上,转化进入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,使用异丙基硫代半乳糖苷进行目的蛋白的诱导表达,用Ni~(2+)亲和层析柱对重组过敏原蛋白进行纯化,使用小龙虾过敏病人混合血清对纯化后的蛋白进行免疫印迹鉴定。结果纯化得到了分子量大小约为40 kDa的重组小龙虾精氨酸激酶,并且重组蛋白与过敏病人血清IgE有明显的特异性结合。结论本实验建立了小龙虾精氨酸激酶的原核表达方法,并鉴定了其免疫原性,为小龙虾过敏的基础研究、临床诊断与治疗奠定了基础。     

重组海参溶菌酶N端可溶性表达与抑菌分析

通过对海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)cDNA(Genbank accession no:EF036468)片段的分析,结果发现N端基因区域所对应的蛋白质序列中含有糖苷酶活性。因此利用RT-PCR技术以其为模板,扩增出长度为174 bp的溶菌酶N端(SjLys-N)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-N,再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组SjLys-N的基因工程菌。该工程菌在改造的LB培养基和最适的发酵条件下经IPTG诱导后,表达约23 kD的重组SjLys-N蛋白。此外,它还能以可溶性的形式表达,占总菌体蛋白约46%。经过Western blotting分析,重组SjLys-N在23 kD左右能够与penta-his抗体发生特异性免疫反应,结果表明重组SjLys-N得到正确的表达。最后对纯化后的重组SjLys-N进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌和副溶血弧菌有较高的抑菌活性。上述结果将为进一步研究海参溶菌酶的基因结构与功能之间的关系提高参考。     

植物乳杆菌DMDL 9010中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

研究了植物乳杆菌DMDL 9010亚硝酸盐还原酶基因克隆、表达及表达产物的纯化。首先以植物乳杆菌DMDL 9010的DNA为模板,利用PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,扩增后nir编码序列大小为1638 bp,再将其编码序列克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化到感受态细胞DH5α,成功构建重组质粒p ET-32a(+)-nir。将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21中,在IPTG浓度为1 mmol/L和诱导温度为25℃的条件下诱导4 h后诱导表达NIR蛋白,经诱导后的工程菌能将50μg/m L的亚硝酸盐降解90%以上,利用亲和层析柱Ni sepharose 6 Fast flow进行纯化得到重组蛋白,该重组蛋白经SDS-PAGE电泳后的分子量约为60 KDa。总之,经由植物乳杆菌DMDL 9010克隆出亚硝酸还原酶基因,并成功构建了重组质粒p ET-32a(+)-nir,利用基因工程方法得到的工程菌能有效降解亚硝酸盐,并能利用亲和层析得到高纯度的NIR。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

单核细胞增多性李斯特菌iap 基因的克隆、表达与p60 蛋白的纯化

以单增李斯特菌基因组DNA 为模板,利用自行设计的引物,通过PCR 法扩增出单增李斯特菌的iap 基因。在iap 基因的5 ＇端和3 ＇端分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ 2 个酶切位点将其克隆到pMD-18T 载体上,构建克隆载体pMD-18T-iap。经测序正确后,将iap 基因克隆至表达载体pET-28a 上构建表达质粒pET-28a-iap。在IPTG 诱导下,携带pET-28a-iap 的E.coli BL21(DE3)高效表达分子质量约为60kD 的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白含量的76.3% 左右。诱导表达的可溶性蛋白通过Ni2+ 亲和层析柱纯化得到纯度在95.6% 以上的重组p60 蛋白,其提取率为68.3% 左右。     

泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的克隆表达

目的:对植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因(nirS)进行克隆及表达,检测重组酶表达情况及其酶活力。方法:以分离自传统泡菜植物乳杆菌的基因组DNA为模版进行PCR扩增nirS;重组构建TA克隆质粒pMD 19-T-nirS,并转化到大肠杆菌DH5a中保存;通过双酶切消化将nirS基因连接到pET-32a(+)上,获得重组表达质粒pET-32a(+)-nirS,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;重组酶经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测其表达情况;重组酶经复性后检测其酶活力。结果:扩增得到nirS基因并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,所得重组酶以包涵体形式存在,酶活力为2131.5U/mg。结论:采用基因工程技术获得亚硝酸盐还原酶具有一定的应用前景。     

金黄色葡萄球菌噬菌体qdsa001内溶素的特性预测及克隆表达

为获得噬菌体qdsa001的内溶素,本实验首先利用多种在线软件对内溶素lys56（GenBank：ARQ95812.1）的理化性质、信号肽、跨膜域和结构域等特性进行分析,然后选择克隆表达法制备目的蛋白。将合成的目的基因插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET-30a-lys56,转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中,获得表达稳定的基因工程菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,利用镍琼脂糖亲和层析纯化表达产物。经在线软件预测结果显示,该蛋白分子质量为35.1 kDa,无信号肽和跨膜域,仅含有一个Ami_2结构域。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示重组蛋白表达成功,且以可溶性蛋白的形式存在于细胞破碎上清液,分子质量约35?kDa,与预期蛋白大小一致。重组蛋白最佳表达条件为：IPTG浓度0.5?mmol/L,20?℃过夜诱导。     

几丁质裂解性多糖单加氧酶的表达及应用研究

以具有几丁质降解能力菌株Chitiniphilus sp. LY72的裂解多糖单加氧酶（CsLPMO）为研究对象，在克隆CsLPMO全长基因的基础上对其进行生物信息学分析，利用3种表达质粒pET-22b、pET-28a和pCold，构建CsLPMO异源表达菌株EBL-22、EBL-28和EBL-Co。重组CsLPMO蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，筛选最佳表达质粒，对其表达条件进行优化。结果表明，CsLPMO是一种裂解性多糖单加氧酶，隶属于AA10家族。3株重组菌中，纯化重组酶蛋白相对含量分别为5.9%、4.1%、5.4%，比酶活力分别为155.42 U/mg、80.26 U/mg、148.29 U/mg，因此，确定最佳质粒为pET-22b，菌株EBL-22表达条件为：OD600 nm值至0.4时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4 mmol/L后，在25 ℃下诱导表达16 h。在优化条件下，其可溶性蛋白含量为928.32 mg/L，比酶活力为3.34 U/mL。CsLPMO的加入可使还原糖的产量提高1.67倍。     

蜡样芽孢杆菌LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆和生物信息学分析

为研究蜡样芽孢杆菌LJ01(Bacillus cereus LJ01)中亚硝酸盐还原酶(NiR)的酶学性质,获得高表达量的基因工程菌,本文对B.cereus LJ01的NiR序列进行了生物信息学分析,并将NiR基因克隆到表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,随后探究了不同诱导条件对重组NiR表达量的影响。结果表明NiR编码蛋白的理论分子量约为60 kDa,理论pI为5.47,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,是不具有跨膜结构的亲水性蛋白。随着诱导温度的升高,重组NiR的表达量逐渐减少,诱导温度为16℃时重组NiR表达量最高。在同一诱导温度下,NiR在pET-28a(+)-nir-BL21中的表达量明显高于pET-32a(+)-nir-BL21,因此选用pET-28a(+)-nir-BL21作为基因工程菌。从B.cereus LJ01中克隆了NiR基因,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21,为该重组NiR的理化性质研究和食源芽孢杆菌中NiR的异源表达奠定了基础。     

重组牛乳铁素融合表达质粒的构建及其抑菌活性分析

为建立生物合成牛乳铁素的方法,根据牛乳铁素氨基酸序列确定其编码序列,利用PCR 技术获得基因扩增产物,接着将该产物与编码鱼腥蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120 的DNA 聚合酶基因dnaENI 中断裂的内含肽基因Asp dnaEIn 的PCR 产物进行重组PCR,将获得的重组融合基因再克隆到表达载体pET-28a 构建重组融合表达质粒。结果显示,融合表达质粒转化大肠杆菌后经诱导能在大肠杆菌表达宿主Escherichia.coli BL21(DE3) 中大量表达,且细胞裂解液与纯化的Anabaena sp. PCC 7120中含断裂内含肽Asp DnaEIc的DNA聚合酶蛋白DnaECI混合反应后对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。     

特氏杜氏藻中乙酰辅酶A合成酶的基因克隆、表达、纯化及活性测定

乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化合成乙酰辅酶A,它是油脂代谢和醋酸盐代谢的重要节点之一。本研究利用反转录PCR(RT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离得到了特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)乙酰辅酶A合成酶(Dt ACS)的c DNA全长(2464 bp),预测其开放阅读框(ORF)为2184 bp,727个氨基酸由此段编码。序列比对显示Dt ACS与绿藻ACS最为相似(与衣藻Chlamydomonas reinhardtii有68%一致;与团藻Volvox carteri f.nagariensis有70%一致)。选用带有硫氧还蛋白标签(Trx-tag)的pET32a(+)作为原核表达载体,并将Dt ACS转入pET32a(+)中从而构建了pET-32a-Dt ACS质粒。将其转入BL21(DE3)感受态细胞中,同时将pET-32a空载体也转入BL21(DE3)感受态细胞中,分别得到重组菌pET-32a-Dt ACS-BL21(DE3)和对照菌种pET-32a-BL21(DE3)。将重组菌在18℃、终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下诱导12 h,表达出来的带有Trx-His标签融合蛋白的Dt ACS约为8.74 ku(6.99ku+1.75 ku)。此外,将表达得到的重组蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化,纯化后蛋白比活力为52.87 U/mg。