面包酵母生物合成ATP的影响因素及机理初探

在对面包酵母生物合成ATP的影响因素研究的基础上,初步探讨了生物合成ATP的反应机理.研究结果表明在反应体系中直接添加终体积分数为0.5%的甲苯,可显著提高面包酵母细胞膜通透性.Mg2 对ATP的合成影响很大,当Mg2 抖浓度为40 mmol/L时,ATP合成量达到最大值,为9.02 mmol/L.在面包酵母生物合成ATP的过程中,当葡萄糖磷酸化和腺苷磷酸化反应竞争时,葡萄糖磷酸化快于腺苷磷酸化,在体系中其它需能反应结束后ATP才开始大量积累.在面包酵母经糖酵解途径生物合成ATP的前期,NAD的再生主要通过形成甘油和乙醇来实现,而在生物合成ATP的中期和快速合成期,NAD的再生主要是通过形成乙醇来实现.     

大肠杆菌—面包酵母种间耦合ATP再生系统中生物合成谷胱甘肽

利用混合悬浮培养的方法,构建了一个由重组大肠杆菌的谷胱甘肽生物合成酶系与面包酵母的糖酵解途径组成的ＡＴＰ再生系统,验证了该系统用于谷胱甘肽（ＧＳＨ）生物合成的可行性．研究了葡萄糖浓度、细胞量对耦合系统合成ＧＳＨ 能力的影响,讨论了所构建的ＡＴＰ再生系统中ＧＳＨ 合成能力较低的可能原因．     

高产谷胱甘肽面包酵母菌种的筛选与发酵条件优化

通过摇瓶试验筛选出谷胱甘肽含量较高的面包酵母BY-14为试验菌株,对产谷胱甘肽的发酵条件进行了优化,其最适的培养条件为:转速160 r/min,发酵时间22 h,温度28℃,接种量10%,装液量50 mL.在优化的条件下,谷胱甘肽的含量达到16.04 mg/g,为初始条件下的1.48倍.     

温和压力对面包酵母CICC1447谷胱甘肽合成的影响

研究了保压时间、压力和升降压速率对面包酵母CICC1447谷胱甘肽(GSH)生物合成能力的影响。以高纯空气(O2∶N2=21∶79)为加压介质,通过单因素实验确定了最优加压条件。实验结果表明,在温和压力刺激条件下酵母菌受可产生应激性反应。谷胱甘肽在最适条件(保压时间6 h、压力0.5 MPa、升降压速率0.05 MPa/min~0.10 MPa/min)下的最大产量比常压下提高了17.21%。结果表明温和压力可以提高微生物重要应激产物谷胱甘肽的产量。     

耦合吸附树脂对细胞酶法合成谷胱甘肽的影响

通过静态吸附-解吸试验从3种吸附树脂中筛选出最适合分离谷胱甘肽（GSH）的树脂,将其与酵母渗透细胞耦合,通过补加前体物质,酶法合成GSH。结果表明,在试验的3种树脂中,D301吸附效果最佳。采用单因素和正交试验法,确定酶法合成GSH的优化工艺为：反应2.0 h后添加树脂2.0 g/10 mL,反应3.0 h时补加60%初始浓度的前体物质,最终得到GSH产量1 154 mg/L,与未添加树脂和前体合成法相比GSH产量提高77.5%。     

提高耦合系统ATP再生效率促进谷胱甘肽合成的研究

利用重组Escherichia coliΔadd/ade(pBV03)和Saccharomyces cerevisiaeWSH2构建了一个生物合成谷胱甘肽(GSH)的种间耦合系统。在该耦合系统中,一方面,大肠杆菌腺苷脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶的缺失完全切断了E.coliΔadd/ade(pBV03)中不可逆转化腺苷(Ado)生成次黄嘌呤(Hx)的途径;另一方面,利用脯氨酸限制性培养降低了酿酒酵母WSH2中ADE的活性,进一步降低了耦合系统中从Ado到Hx的不可逆转化。以上两方面大大降低了耦合系统中从Ado到Hx的不可逆转化,从而保证更多的底物Ado被S.cerevisiaeWSH2用于再生ATP,最终耦合系统中ATP再生的效率大大提高。反应6 h后,该耦合系统GSH的合成量达到13.68mmol/L,为对照的5.14倍。     

酸胁迫对S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽生物合成的影响及其生理机制

在高密度培养条件下,考察不同p H值环境对产朊假丝酵母生物合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的影响。结果发现弱酸胁迫(pH 3.5)有利于提升酵母细胞的SAM和GSH合成能力,实现SAM和GSH联合高产。通过对关键酶活性、能量物质供给和胞内氧化还原环境进行测定,发现弱酸胁迫提高了SAM合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、己糖激酶、ATP合成酶以及过氧化氢酶的活性,提高了胞内NADH和ATP的水平和再生能力,为SAM和GSH的过量合成提供了充足的物质和能量保障。研究结果揭示了弱酸胁迫促进SAM和GSH生物合成的生理机制,也为类似小分子活性化合物的过量合成提供可行的思路。     

酵母线粒体ATP合酶活性对谷胱甘肽合成的影响

以酿酒酵母为菌种,采用PDA基本培养基,研究在不同的培养温度、时间和初始pH值条件下线粒体ATP合酶活性对谷胱甘肽(GSH)合成的影响.结果表明:①初始pH6.0时,30℃培养24 h,线粒体ATP合酶活性和GSH含量均达到了最高,分别为15.73 μmol/mg·protein·h和1.27 μmol/g·FW;②在最适温度30℃、pH6.0条件下培养,线粒体ATP合酶活性在培养48 h达到最大,GSH含量在培养60 h达到最大;③初始pH 6.0时,在24℃条件下,线粒体ATP合酶活性保持稳定,GSH含量随时间增加而增加.在34℃时,线粒体ATP合酶活性在24 h最大,GSH含量在36 h达到最高;④初始pH 6.0时线粒体ATP合酶活性达到最大,GSH含量最高.实验结果表明,酵母线粒体ATP合酶在不同培养条件下活性是不同的,同时也说明了ATP合酶活性与GSH的合成有密切的关系.     

产酯酵母和耐高温酵母原生质体形成与再生条件研究

选取脱壁预处理时间、蜗牛酶浓度、酶解时间三因素设计三因素三水平正交试验来研究产酯酵母和耐高温酵母原生质体形成与再生条件。结果表明,产酯酵母原生质体形成与再生最佳条件为：预处理20min、1%蜗牛酶酶解30min;耐高温酵母为：预处理10min,1.5%蜗牛酶酶解60min。     

辅助能量物质与谷胱甘肽协同作用促进环磷酸腺苷发酵生产

目的:探究添加辅助能量物质导致环磷酸腺苷（cAMP）发酵后期产物合成停滞的原因,针对性解除限制因素,进一步提高产物产量。方法:在7 L发酵罐上进行添加辅助能量物质的发酵实验,对发酵动力学参数、细胞活性、能量代谢水平以及活性氧（ROS）含量等进行分析,根据分析结果进行了耦合添加谷胱甘肽和辅助能量物质的发酵实验。结果:单独添加柠檬酸钠、丙酮酸钠批次的产物合成和菌体生长速率在发酵前期均明显高于对照,约30 h后快速下降,降至低于对照批次的低水平;菌体活性、ATP/AMP以及电子呼吸链活性在发酵36 h后也剧烈下降,下降幅度远远大于对照批次。添加辅助能量物质导致ROS和丙二醛在发酵36 h后迅速积累,极显著（P<0.01）高于对照批次,而NADPH/NADP+却快速下降,明显低于对照。耦合添加辅助能量物质和谷胱甘肽的发酵批次中,细胞活性得到较大提升,cAMP产量得到进一步提高。柠檬酸钠耦合GSH批次与丙酮酸钠耦合GSH批次的cAMP产量分别达到4.05和4.32 g/L,比单独添加GSH批次分别提高了15.2%和22.7%,与对照（无辅助能量物质和谷胱甘肽添加）相比分别提高了21.9%和30.1%。结论:辅助能量物质强化能量代谢促进产物合成的同时,增加了电子呼吸链中电子泄漏的几率,大量活性氧产生超出细胞承受能力,导致发酵后期细胞生长和产物合成的停滞。辅助能量物质与谷胱甘肽协同作用,有效缓解了氧化胁迫,提高细胞活性,进一步促进产物发酵生产。     

利用木糖高产谷胱甘肽酵母菌株的诱变选育及培养条件优化

以CT1463(热带假丝酵母)为出发菌株,经紫外诱变结合镉盐平板筛选,获得-株高产谷胱甘肽的突变株CV26,其谷胱甘肽产量和舍量分别为45.4mg/L和7.05mg/g,较出发菌株提高了41%和52%.对CV26发酵条件进行了优化,在优化发酵条件下谷胱甘肽产量和含量分别为128.70 mg/L和14.31 mg/g,分...     

基于双菌耦合发酵策略的烟酰胺单核苷酸合成

本研究构建了分别含有烟酰胺核苷激酶（nicotinamideribosidekinase,NRK）和多聚磷酸酶（polyphosphatekinase,PPK）的双菌耦合发酵体系，实现了基于PPK的ATP再生系统在烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide,NMN）生产中的应用。首先分别构建表达NRK1和NRK2的工程菌株，筛选得到高活性的大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)-pET28a-NRK1,NMN产量5.17 g/L，产率77.4%；然后对NRK1的诱导表达条件进行优化，发现低温16℃、异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷0.7 mmol/L、接种量3%、诱导时长22 h更利于蛋白的可溶性表达；进一步对E. coli BL21(DE3)-pET28a-NRK1合成NMN的最优体系进行探索，发现在菌体质量浓度100 g/L、温度18℃、时间12 h、ATP与烟酰胺核糖（nicotinamide riboside,NR）浓度比1∶1.5时，NMN产量最高为5.73 g/L，产率85.78%；最后，通过对E. coli BL21(...     

两阶段pH控制方式提高富硒产朊假丝酵母的性能

为了提高富硒产朊假丝酵母的性能,本文在摇瓶培养和分批培养的基础上,考察了不同pH控制方式对流加培养条件下富硒产朊假丝酵母细胞生长、谷胱甘肽（GSH）合成和有机硒转化的影响,结果发现：在12 h将pH从3.5切换至5.5（pH 3.5→5.5）的两阶段pH控制方式最有利于富硒产朊假丝酵母胞内GSH和有机硒含量的提高。在pH 3.5→5.5条件下,富硒产朊假丝酵母胞内GSH含量、有机硒含量和有机硒转化率分别达到最大值13.09 mg/g、1.88 mg/g和94.69%。通过对酵母胞内GSH合成关键酶活性、氧化还原酶活性和能量代谢物质ATP水平进行测定,发现pH 3.5→5.5两阶段pH控制方式提高了富硒酵母胞内过氧化氢酶活性,降低了丙二醛含量,为酵母进行有机硒富集与转化以及GSH合成与积累提供了合适的氧化还原环境,并最终提高了富硒酵母的性能。     

四种酵母甘露聚糖合成与释放特性的比较

比较了产朊假丝酵母、毕赤酵母、面包酵母和啤酒酵母培养过程中细胞壁甘露聚糖的合成与释放特性。结果表明:四种酵母的甘露聚糖合成均为生长偶联型;不同类型酵母的甘露聚糖合成能力差异显著(p0.05),合成能力最强的啤酒酵母细胞壁甘露聚糖含量最高可达0.62g/L发酵液,而合成能力最弱的毕赤酵母仅为0.47g/L发酵液。四种酵母的甘露聚糖最大释放量均出现对数生长中期,并且不同类型酵母释放效率差异较大,最高值毕赤酵母甘露聚糖释放量达到了0.27g/L发酵液,最低值啤酒酵母仅有0.15g/L发酵液。乙醇显著刺激四种酵母的甘露聚糖释放(p0.05),其中对产朊假丝酵母的影响最显著且在5%乙醇浓度下,与对照相比,其甘露聚糖释放量和释放率分别大幅提高了152%和120%。     

海藻酸钠明胶协同固定化酵母生产ATP

采用海藻酸钠与明胶协同固定化酵母合成ATP,考察了海藻酸钠、明胶浓度、酵母包埋量、交联剂浓度与交联时间等因素对固定化酵母胶体的机械强度、合成ATP转化率的影响,以及葡萄糖与牛血清蛋白向固定化酵母胶体内扩散的状况。结果表明,利用非稳态传递模型计算得到葡萄糖的有效扩散系数为5.82×10~(10)m~2/s,而BSA(V)不能扩散进入该固定化颗粒。进一步考察反应条件的影响,确定优化的反应条件为固定化酵母400 g/L.蔗糖80 g/L,KH_2PO_416 g/L,K_2HPO_4 92 g/L,MgSO_4 8 g/L,腺20 g/L,在该条件下得转化率平均在90%以上。     

复配大豆磷脂和蔗糖酯对面包酵母冷冻保护作用

以质量比为2∶1的大豆磷脂和蔗糖酯复配处理面包酵母,研究了其对酵母抗冻性的影响。结果表明,与未添加乳化剂组相比,酵母在-30℃含复配乳化剂质量分数为4 g/dL的YPD培养液中冷冻贮藏5 d,解冻并于30℃平板培养48 h,存活率提高了60%,酵母生长适应期缩短了10 h左右。将乳化剂处理酵母应用于冷冻面团体系,面团经-30℃冷冻贮藏60 d后醒发时间缩短,醒发体积增大。扫描电镜观察表明酵母与乳化剂呈聚集状,存在一定的交互作用。     

超氧化物歧化酶重组酵母的构建及其发酵条件的优化

超氧化物歧化酶(SOD)由于具有高效清除氧自由基的作用而广泛用于食品、日化和医药领域。作者研究了提高SOD产量的基因工程新方法。利用密码子优化后人源铜锌超氧化物歧化酶基因,构建亚克隆及表达载体,最终转化进巴斯德毕赤酵母进行表达。通过正交试验,分析工程菌的最适摇瓶表达条件。摇瓶正交试验确定最优表达条件为:28℃,诱导剂体积分数1.0%,接种体积分数1.0%,最优表达水平为2 339.4 U/mL,与现有的一些研究相比,其表达量提高了近3倍。这些结果表明:对人源铜锌SOD经过适当的密码子优化和发酵条件优化,使酵母表达量显著提高,有助于解决SOD原料来源的局限。     

离子束重组异常汉逊酵母菌Ar_Han0458的转录组学分析及谷胱甘肽代谢途径富集

研究可稳定遗传的重组异常汉逊酵母Ar_Han0458在发酵过程中的差异基因表达信息及与谷胱甘肽代谢相关基因的表达变化。利用生物信息学方法分析重组异常汉逊酵母Ar_Han0458的5个发酵时间点的RNA-seq数据。重组异常汉逊酵母Ar_Han0458各发酵时间与0 h相比,下调表达基因数量多于上调表达;除发酵96和72 h外,相邻时间点的差异表达基因数目均以下调为主;发酵48和72 h时的基因表达谱相近。各发酵时间点间差异表达基因显著富集的GO功能均以细胞过程、细胞和催化活性为主。KEGG富集分析显示,10个差异表达基因参与了谷胱甘肽的代谢,谷胱甘肽的合成速率分别在24和96 h达到峰值,与实验测得胞外GSH产量变化趋势一致。重组异常汉逊酵母Ar_Han0458在发酵96 h时差异表达基因数目以上调为主,且谷胱甘肽合成速率最快。该研究为重组异常汉逊酵母的代谢调控研究及其分子育种提供了理论依据。     

麸皮、米糠制取饲料蛋白的研究

研究了麸皮、米糠水解液培养酵母的工艺条件。在最适培养条件下 ,酵母产量达 1 1 .0g/L(干 ) ,蛋白质含量达 45 %～ 5 0 % ,含有多种氨基酸 ,具有和鱼粉相同的功效     

基于响应面法优化酿酒酵母培养体系

该研究以小麦胚芽为原料,2,6-二甲氧基对苯醌（2,6-DMBQ）产量为评价指标,对发酵菌种进行筛选并考察原料预处理方式的影响。在此基础上,采用单因素试验及正交试验对发酵条件进行优化。结果表明,最适发酵菌种为低糖面包酵母;最佳原料预处理方式为超声处理;低糖面包酵母发酵小麦胚芽产2,6-二甲氧基对苯醌的最优发酵条件为菌种添加量1∶8（酵母与麦胚质量比）,料液比1∶15（麦胚与水质量比）,发酵时间42 h,发酵温度28 ℃。在此最优发酵条件下,2,6-二甲氧基对苯醌的产量最高为（765.23±9.11） μg/g。