乌拉尔甘草内生真菌的分离及其抑菌活性研究

研究乌拉尔甘草内生真菌及其次生代谢产物的抑菌活性,旨在获得有良好抑菌活性的菌株,寻找新型抗菌物质。以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、酿脓链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和白假丝酵母为试验菌株,用菌饼法及纸片法对分离的真菌及其次生代谢产物进行抑菌试验。从乌拉尔甘草中分离到46株内生真菌,其中34株内生真菌对指示菌表现出不同的抑菌活性,占总分离菌株的74%;20株内生真菌的发酵液对指示菌株也有一定的抑制作用,占总分离菌株的43%。乌拉尔甘草的内生真菌及其次生代谢产物中存在着丰富的抑菌天然活性物质,这可为新型抗菌物质提供资源。     

南瓜中内生菌筛选及其次级代谢产物的分析

目的：为充分开发利用南瓜资源,寻找生产多酚类化合物等活性物质的内生菌。方法：采用组织块分离法、划线分离法及梯度稀释法获得南瓜果肉中的内生菌,并利用平板对峙法对其抑菌活性进行测定,再以南瓜提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析分析,然后利用高效液相色谱法作进一步检测,从而确定活性物质的种类。结果：从南瓜果肉中共分离到54 株内生菌。通过抑菌实验发现其中12 株对一种或多种指示菌具有抑菌活性,占分离菌株数的22%,其中3 株（25、26、29号）具有较广谱抑菌活性,抑菌率较高,可达（36.73±0.52）%。薄层层析检测表明：25号菌株的发酵产物在比移值（Rf）为0.57时与标准南瓜提取液斑点Rf相同。结论：25号菌株能发酵产生多酚类或类似化合物,这为利用内生菌发酵生产多酚类成分提供了新的思路和途径。     

藿香内生真菌次级代谢产物抗菌活性研究

【目的】分离纯化藿香花中内生真菌,测定内生真菌次级代谢产物抑菌活性。方法采用组织分离法从藿香花中分离内生真菌,根据显微形态结构进行初步鉴定;用微量肉汤稀释法测定藿香内生真菌次级代谢产物的最低抑菌浓度(MIC)。结果从藿香茎中共分离得到13株内生真菌,鉴定出12株,分别属于丝核菌属、黑孢霉属、长蠕孢菌属、短蠕孢菌属、丝孢菌属、链格孢菌、镰刀菌属、头孢霉属。大多数藿香内生真菌次级代谢产物的乙酸乙酯部位具有抗菌活性。菌株H-2的乙酸乙酯部位抑菌活性最强,对六种供试菌的MIC均为250μg/mL。菌株H-9的乙酸乙酯部位对无乳链球菌的抑制活性最好,为31.25μg/mL,对其他供试菌在500μg/mL能够表现出抑制活性。结论藿香内生真菌的次级代谢产物具有抑菌活性,为进一步的活性指导分离提供了理论依据。     

罗布麻内生细菌的分离鉴定及抑菌活性

目的:研究罗布麻内生细菌及其抑菌活性,旨在深入开发新资源。方法:以红花罗布麻为研究对象,采用平板分离法从中分离内生细菌,利用牛津杯法对其发酵物进行抑菌活性研究,对有抑菌活性的菌株进行形态特征观察和16S rRNA序列同源性分析。结果:筛选出的D1菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌四株供试指示菌均有明显的抑制作用,D3菌株对藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用。结合菌株的形态学特征和16S rRNA序列同源性分析,将D1鉴定为假单胞菌,D3鉴定为菠萝泛菌。结论:罗布麻中蕴含着具有抑菌活性的内生细菌资源,可进一步的开发利用。     

传统浆水中乳酸菌的筛选及抑菌性能分析

以甘肃传统发酵浆水为材料,采用平板划线法分离纯化其中的乳酸菌,并对纯化后的菌株进行形态学观察及生物学特性分析,筛选出其中具有抑菌活性的菌株,分别研究它们的抑菌能力以及抑菌物质的成分。结果表明:6株乳酸杆菌中,菌株SJ-1、SJ-2的发酵代谢产物对指示菌具有较高的抑菌活性。排除酸抑制作用和过氧化氢抑制作用后代谢产物仍具抑菌活性,且显示出良好的热稳定性。使用不同的蛋白酶对代谢产物进行处理后,其抑菌能力产生了程度不等的降低,表明抑菌物质具蛋白酶敏感性,因此判断抑菌物质中含有蛋白类抑菌成分。经鉴定发现菌株SJ-1为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),SJ-2为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。     

盐生海芦笋抗菌内生细菌的筛选与鉴定

以抗菌活性为指标,从野生海芦笋中筛选与鉴定具有抗菌活性的内生细菌。采用平板分离与斜面纯化的方法,从海芦笋中分离到13株内生细菌,经过对8株病原菌抗菌活性测试,菌株HLS-7和HLS-8对大肠杆菌(Escherichia coli)、金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和白假丝酵母(Candida albicans)均显示了较强的抑制活性,其抑菌圈直径均10 mm;对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella penumoniae)均显示了中等抗菌活性,表现出广谱的抑菌活性。PCR扩增这2株菌的16S r DNA区域,单克隆后测序进行同源性分析,构建系统发育树,结合形态学观察和生理生化实验,将菌株HLS-7和HLS-8分别鉴定庆生芽孢杆菌(Bacillus qingshengii)和甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。通过电喷雾质谱分析这2株菌的发酵产物,结果显示,菌株HLS-7可产生脂肽类化合物Fenycin和Iturin,菌株HLS-8可产生脂肽类化合物Iturin,提示这2株菌的抗菌活性可能源于脂肽化合物。     

君子兰内生真菌的分离纯化及其代谢产物抑菌活性的研究

采用表面消毒法、划线分离法分别从君子兰根、茎、叶中分离获得6株形态特征不同的优势内生真菌;发酵其中4株后,分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取发酵液得8种提取物,并分别检测了这8种提取物对大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、乳链球菌、绿脓杆菌的抑菌活性。结果表明：大部分组分表现出了较好的抑菌活性,其中儿乙酸乙酯提取部位活性最好,可作为日后活性菌株发酵。     

生物保鲜乳酸菌的筛选及其细菌素特性研究

利用牛津杯法从传统泡菜和腊肠中分离的80株乳酸菌中筛选出10株具有较高抑菌活性的乳酸菌.通过排除酸性产物有机酸、过氧化氢干扰及抑菌谱试验,LAB5和LAB55仍表现广谱的抑菌活性;2菌株发酵上清液经蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶处理后抑菌活性均有降低,其中LAB5对木瓜蛋白酶敏感,因此可以初步判定这2株乳酸菌产生的抑菌物质为细菌素.2种细菌素具有良好的热稳定性,pH值越低抑菌能力越强;2株菌表现良好的产酸能力,经生理生化和16S rDNA鉴定为植物乳杆菌.     

一株具α-糖苷酶抑制活性、抗氧化和抗细菌活性的香椿内生真菌的筛选与鉴定

采用平板法与斜面纯化法从河南红油香椿中分离内生真菌,并采用紫外分光光度法测定其次级代谢产物的α-糖苷酶抑制活性及抗氧化活性,牛津杯法测定其抗细菌活性,采用分子生物学方法鉴定高活性菌株。从香椿中共分离得到内生真菌6株,其中,菌株56-50的次级代谢产物具有最高α-糖苷酶抑制活性,为(24.98±1.89)%。菌株56-50和TS47均具有较好的抗氧化活性,其中,菌株56-50对ABTS~+·和DPPH·的清除活性分别为(95.92±0.40)%和(91.77±0.45)%,TS47对DPPH·的清除活性为(94.55±0.15)%。菌株56-50和TS8分别对豪氏变形杆菌和欧文氏菌具有较强抑制活性,抑菌圈为(20.33±0.08)mm和(15.11±0.07)mm。综上,菌株56-50均具有较好的α-糖苷酶抑制活性、抗氧化和抗细菌活性,并根据18S rDNA测序结果将其鉴定为链格孢属。该研究为利用植物内生真菌发酵生产α-糖苷酶抑制剂、天然抗氧化剂和抗菌剂提供理论依据。     

鲜天麻内生菌分离鉴定及功能活性探究

目的:明确天麻内生菌及其代谢产物的活性。方法:采用组织匀浆法和划线法从秦巴地区鲜天麻中分离纯化内生菌,测定其抗菌、抗氧化及抗肿瘤活性,并对高活性菌株进行分子生物学鉴定。结果:从鲜天麻内部分离得到4株菌,其中内生菌B1、B2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性,内生菌B2对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径达26.33 mm。4株菌均有一定的抗氧化活性,其中,内生菌B1对DPPH自由基的清除能力为69.13%。内生菌B2、B3、B4对HEK293T细胞有一定的抑制作用,其中内生菌B2的最高抑制率可达40.40%。分子生物学方法鉴定结果表明,内生菌B1、B2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),内生菌B3为Lelliottia sp.,内生菌B4为水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)。结论:分离纯化的鲜天麻内生菌具有抑菌和抗氧化活性。     

产细菌素乳酸菌的筛选及鉴定

从传统发酵制品中分离筛选到50株乳酸菌,通过琼脂扩散法从中筛选出5株对指示菌具有明显抑菌作用的菌株,通过排除酸和过氧化氢的作用后,其中一株菌仍具有一定的抑菌活性.用胰蛋白酶对其发酵液进行处理后.活性下降很大,说明代谢产物中含有蛋白性质的抑菌物质,可能是细菌素.对此菌株进行鉴定,初步认为是戊糖乳杆菌,并对其生长能力和产酸能力进行了测定.     

筛选浙贝母内生真菌以及抑菌活性菌株性质研究

目的：对浙贝母内生真菌以及抑菌活性菌株性质进行分析探讨,为今后的研究工作提供可靠的理论依据。方法：采取组织分离印迹对照法自浙贝母植株中分离内生真菌,经牛津杯法对抑菌活性进行筛选,对活性菌株展开发酵培养,并绘制出抑菌活性变化曲线、培养基消耗曲线以及次生代谢产物浓度变化曲线,经高效发酵体系对抑菌活性菌株进行发酵,分离浓缩发酵液后,进行萃取分离。结果：经统计试验中共获得36种内生真菌,低下鳞茎中分离的BJ7具有很高的抑菌活性;发酵9天时的BJ7抑菌活性最佳。结论：浙贝母中可分离得到多种内生真菌,其中以BJ7的抑菌活性最高,应对其给予重视。     

牡蛎共附生可培养微生物多样性的研究

研究牡蛎共附生真菌和细菌的种群多样性。通过牡蛎内生菌群分离、形态学观察、生理生化鉴定及16S r DNA/18S r DNA序列分析等试验,分析牡蛎共生菌的优势种群,并对分离菌的发酵粗产物进行初步成分分析。结果分离获得32株内生细菌,全部属于γ-变形菌纲,其中微球菌和芽孢杆菌为牡蛎内生细菌的优势菌属;分离获得20株内生真菌,分别属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和无性型真菌类(Anamorphic Fungi)中的10个属,其中青霉属和曲霉属为牡蛎内生真菌的优势菌属,占分离总数的40%。发酵液粗产物的薄层层析结果表明牡蛎内生菌的发酵产物成分丰富。研究结果表明牡蛎共附生真菌和细菌具有丰富的种群多样性。     

红豆杉内生放线菌的分离及活性菌株的筛选与鉴定

通过组织匀浆法分离红豆杉(Taxus chinensis)根、茎、叶3个部位的内生放线菌,采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性,并对抑菌活性明显的菌株进行了分子鉴定。结果表明,分离纯化得到内生放线菌55株,抑菌活性试验中共有21株表现出了不同程度的拮抗作用,占全部分离菌株的38.2%,其中4株具有明显的抑菌活性。经16SrDNA序列分析,初步鉴定3株为链霉菌属(Streptomyces sp.),1株为小单孢菌属(Micromonosporasp.)。     

一株丹参种子内生真菌ZJZD-3的分离鉴定及其生物活性

目的:从丹参种子中分离纯化内生菌,筛选具有抑菌、抗氧化、抗凝血活性的菌株进行分子鉴定。方法:采用平板分离法从丹参种子中分离内生菌;采用平板对峙法和滤纸片法筛选具有抑菌效果的内生菌,采用DPPH法测定内生菌抗氧化活性,兔耳缘静脉取血测定内生菌抗凝血活性。结果:从白花丹参种子中分离出11株内生真菌和2株内生细菌,从紫花丹参种子中分离出9株内生真菌和9株内生细菌。其中,一株内生真菌ZJZD-3发酵液对丹参病原菌4和6均有抑制作用,抑制率分别为70.1%和59.6%;内生真菌ZJZD-3具有很好的抗氧化能力,其0.5 mg/mL乙醇粗提液对DPPH清除率为91.44%;内生真菌ZJZD-3对于内源性、外源性凝血途径都具有一定的延长作用,并且内源性凝血途径最为明显,对家兔凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活性部分凝血酶时间(APTT)的延长率分别为48.48%、12.38%和34.44%。该菌株经鉴定为篮状菌属(Talaromyces sp.)。结论:内生真菌ZJZD-3具有很好的抗丹参病原菌、抗氧化和抗凝血能力,为丹参药效成分的工业化开发以及丹参的绿色规模化栽培提供新的途径和方法。     

葡萄抑菌附生细菌筛选鉴定及其结构表征

以夏黑葡萄为研究对象,利用平板划线法分离纯化培养得到附生细菌,通过提取基因组DNA、PCR扩增16S rDNA、基因序列测序,构建系统发育树,进行聚类分析,结合形态学观察,确定菌种的种属地位。在此基础上,以抑菌活性为指标,筛选具有抑菌活性的附生细菌。将筛选到的目标株菌发酵后,采用溶剂萃取得到发酵粗提物,经过电喷雾(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)对发酵产物进行分析,初步确定发酵产物的结构。共从夏黑葡萄中分离鉴定了9株附生细菌,其中BDG-5和BDD-2具有显著的抗菌活性,分别为副假单胞菌(Pseudomonas paralactis)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),ESI-MS分析表明,P.paralactis发酵产物中含有环脂肽surfactin和iturin C,B.velezensis可产生脂肽surfactin、iturin A和bacillomycin D,它们是抑菌活性的主要物质。     

准噶尔山楂果实内生真菌的分离、鉴定及抗菌代谢物质研究

采用组织块法对准噶尔山楂果实中的内生真菌进行分离,采用形态学与分子生物学结合的方法对果实中的内生真菌进行鉴定。利用琼脂块和滤纸片法进行抑菌试验,筛选出具有抑菌活性的菌株。采用薄层层析法（thin layer chromatography,TLC）初步分析发酵液中的有效成分,确定抑菌有效成分后,利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）对其中的有效成分进行含量测定。结果表明：共分离获得内生真菌14株,其中SZ-C菌株及其发酵液均对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较强的抑菌活性,TLC结果显示SZ-C的发酵液中含有槲皮素和山奈酚,HPLC检测结果显示SZ-C的发酵液中含有槲皮素和山奈酚含量分别为1.253 mg/L和1.329 mg/L。根据形态学特征和分子生物学分析确定SZ-C为极细链格孢菌。说明准噶尔山楂果实中存在能产生槲皮素和山奈酚的内生真菌并且具有一定抑菌效果。     

6种药用植物内生菌提取物的抗氧化活性研究

本论文以6种具有抗氧化活性的药用植物乌头、唐松草、独活、车前草、薄荷、泽泻为材料分离内生菌,并对内生菌发酵液和菌丝体提取物中抗氧化活性成分进行了研究。实验以PDA培养基分离内生真菌,以高氏培养基分离内生放线菌,测定各提取样品的抗氧化活性,比较其总酚含量和总黄酮含量,并结合形态学和分子生物学方法对高活性菌株进行的鉴定。结果分别分离得到43株内生真菌,18株内生放线菌,其中内生真菌显示了较好的抗氧化活性,对·OH自由基有较强清除(清除率≥70%)作用的菌株有6株,占所用菌株的9.84%。其中菌株DHL-10发酵液乙酸乙酯提取物显示了较强的抗氧化活性,对过氧化氢的IC50为0.26 mg/m L,总酚和总黄酮含量分别达到了0.81±0.05 mg/g和0.84±0.05 mg/g;分子生物学鉴定结合形态学鉴定该菌株为链格孢菌属(Alternaria sp)真菌。本研究的结果证明,药用植物内生菌是抗氧化活性物质寻找的良好资源。     

马奶酒中抗单增李斯特氏菌细菌素产生菌的筛选及鉴定

从内蒙古传统乳制品酸马奶酒中分离出144株乳酸菌,通过双层琼脂平板扩散法筛选出具有明显抑菌作用的菌株.在排除有机酸、H2O2等的干扰后,其中1株乳酸菌的发酵上清液对受试的单核细胞增生李斯特氏菌表现出明显抑制作用;进一步硫酸铵沉淀、透析及浓缩处理后,其抑菌活性显著增强,说明其代谢产物中含有蛋白质类抑菌物质,可能是细菌素.经生理、生化试验和形态学观察,将该菌株鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium).     

香樟内生细菌的分离与发酵产物抗氧化活性评价

目的:分离香樟内生细菌,评价内生细菌发酵产物抗氧化活性,为香樟开发及其内生细菌作为天然抗氧化活性物奠定基础。方法:采用组织块分离和组织匀浆法分离香樟内生细菌,通过测定发酵上清液的总还原力,以及其对DPPH自由基、超氧自由基和羟自由基等的清除能力,评价内生细菌发酵产物抗氧化活性,并通过16S rRNA基因序列分析对内生细菌进行初步鉴定。结果:从香樟枝条、叶及果实等组织中共获得64株内生细菌,总还原力测定表明67.19%内生菌的发酵产物具抗氧化活性。香樟内生细菌发酵产物对DPPH自由基的清除能力强于对超氧自由基和羟自由基的清除能力。其中,对DPPH自由基具清除能力的内生菌占62.50%,平均清除率为73.96%;对超氧自由基具清除能力的占12.50%,平均清除率为16.49%;对羟自由基具清除能力的仅占6.25%,平均清除率为6.07%。初步鉴定表明,具抗氧化活性的内生细菌均为芽孢杆菌属(Bacillus)。结论:香樟内生细菌发酵产物具较强的抗氧化活性,可作为筛选开发天然抗氧化剂的潜在资源。