荧光聚合酶链式反应检测白粿干模拟转基因样品前处理优化

为提高米制品中转基因成分实时荧光聚合酶链式反应检测的灵敏度与检出率,应用模拟转基因白粿干样品,对影响检测结果的主要因素,包括样品颗粒细度、DNA提取过程中样品在十六烷基三甲基溴化铵裂解缓冲液中温育时间等因素进行优化。结果表明:提取的DNA量在样品颗粒细度与十六烷基三甲基溴化铵缓冲液温育时间的9种处理组合间都有极显著差异,其中最优条件为样品颗粒细度100目、十六烷基三甲基溴化铵缓冲液温育时间8 h(过夜)。采用最优前处理组合,样品的主要转基因成分检出限从公认的转基因含量0.01%(m/m)降到0.001%(m/m),检测灵敏度提高10倍,有效提高了米制品转基因成分检测结果的准确性。     

白粿干模拟转基因样品前处理与荧光PCR检测体系的优化

为提高米制品中转基因成分实时荧光聚合酶链式反应检测的灵敏度与检出率,应用模拟转基因白粿干样 品,对影响检测结果的主要因素,包括样品颗粒细度、DNA提取过程中样品在十六烷基三甲基溴化铵裂解缓冲液中 温育时间等因素进行优化。结果表明：提取的DNA量在样品颗粒细度与十六烷基三甲基溴化铵缓冲液温育时间的9 种 处理组合间都有极显著差异,其中最优条件为样品颗粒细度＞100 目、十六烷基三甲基溴化铵缓冲液温育时间＞8 h （过夜）。采用最优前处理组合,样品的主要转基因成分检出限从公认的转基因含量0.01%（m/m）降到0.001%（m/m）, 检测灵敏度提高10 倍,有效提高了米制品转基因成分检测结果的准确性。     

改良十六烷基三甲基溴化铵-磁珠核酸提取方法及在植物转基因检测中的应用

目的 建立一种快速、高效、便捷的植物基因组DNA提取方法并运用于植物转基因检测。方法 改良传统的十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium ammonium bromide, CTAB)方法, 并结合磁珠吸附基因组DNA, 配合核酸自动提取系统提取水稻和加工米粉中的核酸, 荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测Bt63大米转基因成分, 并与另外4种提取方法的结果进行对比, 评价提取效果。结果 5种不同方法中CTAB-磁珠法提取的样品基因组DNA浓度和质量最佳, 荧光PCR检测低浓度Bt63转基因成分(0.01%)的Ct值最小, 检测结果最好。结论 该方法可高效快速地提取植物核酸, 在低含量的转基因成分检测中相比其他几种方法具有绝对优势。     

豆腐中转基因大豆成分的检测

目的探索适合豆腐样品的DNA抽提方法并采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术对豆腐试样中的转基因大豆成分进行检测。方法分别采用CTAB和SDS配制抽提缓冲液提取18个豆腐样品中的DNA,针对转基因大豆都含有大豆内源基因lectin及共同元件CaMV35S启动子、nos终止子及epsps基因进行实时荧光PCR扩增。结果 SDS法比CTAB法提取的豆腐DNA质量更好;18个豆腐样品均检测到了lectin,其中有2个样品检测到了CaMV35S启动子的荧光信号,4个样品检测到了nos终止子的荧光信号,所有样品均未扩增出epsps基因。结论 SDS法比CTAB法更适合于抽提豆腐样品的DNA,提取到的DNA可用于实时荧光PCR法检测豆腐内源基因和外源基因。     

蛋白粉中转基因成分实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立了应用实时荧光定量PCR技术检测蛋白粉中转基因成分的方法。通过提取DNA,优化时荧光定量PCR反应体系条件,建立了一种简便快速的检测蛋白粉中转基因成分的方法,具有良好特异性和灵敏度,检出限为0.05%。该方法检测条件稳定,样品前处理简单,是一种快速简便、可靠的方法,适合于推广使用。     

实时荧光定量PCR技术检测腐乳中大豆转基因成分

优化实时荧光定量PCR反应体系条件,运用此技术检测从腐乳中提取的DNA来判定腐乳样品是否含有大豆转基因成分。该检测方法特异性强、灵敏度高,方法检出限为0. 1%,而且操作简便,可以推广使用。     

市售豆瓣酱的转基因检测分析

转基因食品的安全是消费者关心的热点问题,尤其是转基因大豆深加工制品。以3种市售大豆豆瓣酱为材料,采用的CTAB改进方法对其进行了DNA提取,并鉴定了提取的DNA质量,凝胶电泳和PCR结果显示所提取的DNA能对内参基因进行有效扩增,表明了豆瓣酱的DNA提取的有效性,可以满足后续PCR的要求;在此基础上采用PCR方法检测了35S和NOS基因,结果显示待检测样品中不含转基因成分。豆瓣酱转基因检测方法的建立为今后同类产品的转基因评价提供了有效参考。     

速冻面米制品中金黄色葡萄球菌DNA提取方法的比较分析

DNA的提取效率是影响食品中致病菌PCR检测的关键因素。以速冻面米制品中最易污染的金黄色葡萄球菌为研究对象,比较4种DNA提取方法(CTAB法、离心柱法、氨基化纳米磁珠法、羧基化纳米磁珠法)的效率和质量,对提取的DNA采用荧光定量PCR方法评价。结果表明,在三大类速冻面米制品(肉馅类、素馅类和无馅类)人工污染金黄色葡萄球菌的样品中,羧基化纳米磁珠法和氨基化羧纳米磁珠法的提取效率显著优于CTAB法和离心柱法,可推荐为速冻面米制品中金黄色葡萄球菌污染快速定量检测的DNA提取方法 。     

几种提取转基因木瓜DNA的方法比较

目的 比较CTAB法、SDS法及试剂盒法分别提取木瓜果皮、果肉、种籽DNA的效果, 以提高转基因木瓜的检测准确率。方法 对转基因木瓜内源基因Papain及外源基因NPTII、CP进行普通PCR, 同时对基因表达零件CaMV35S启动子和NOS终止子进行荧光PCR, 以检测提取DNA的质量。结果 分析电泳产物发现, SDS法提取木瓜种籽样品的DNA未能适合普通PCR检测的要求, 其他方法均能满足普通PCR要求。荧光PCR结果显示, 3种方法提取的DNA都满足荧光扩增要求。结论 比较3种提取方法及3种木瓜材料, 发现用CTAB法或SDS法以果皮为材料提取DNA质量最佳。     

实时荧光PCR法测定婴幼儿谷类辅助食品中麸质过敏原成分

目的建立实时荧光PCR法检测婴幼儿谷类辅助食品中麸质过敏原成分的含量。方法样品加入淀粉酶液化后,采用试剂盒方法提取样品DNA,考察大麦Hordein基因、小麦Gliadin基因、黑麦Secl基因和燕麦Avenin基因检测方法的特异性、灵敏度和检出限,幵应用于检测实际样品。结果确定了实时荧光PCR反应体系条件,各个基因的检测方法具有特异性强且灵敏度高,检出限为0.1%。结论该方法操作简便,准确率高,适用于婴幼儿谷类辅助食品中麸质成分的检测。     

几种提取转基因木瓜DNA方法的比较

目的比较CTAB法、SDS法及试剂盒法分别提取木瓜果皮、果肉、种籽DNA的效果,以提高转基因木瓜的检测准确率。方法对转基因木瓜内源基因Papain及外源基因NPTII、CP进行普通PCR,同时对基因表达零件Ca MV35S启动子和NOS终止子进行荧光PCR,以检测提取DNA的质量。结果分析电泳产物发现,SDS法提取木瓜种籽样品的DNA未能适合普通PCR检测的要求,其他方法均能满足普通PCR要求。荧光PCR结果显示,3种方法提取的DNA都满足荧光扩增要求。结论比较3种提取方法及3种木瓜材料,发现用CTAB法或SDS法以果皮为材料提取DNA质量最佳。     

大豆卵磷脂DNA的提取方法及应用

以大豆卵磷脂为研究对象,比较了CTAB法、磁珠试剂盒法以及硅胶膜试剂盒法等3种DNA提取纯化方法。通过大豆内源基因Lectin实时荧光PCR检测,发现CTAB法提取的大豆卵磷脂DNA质量优于其它两种方法,并以CTAB法为基础进行条件优化,进一步提高DNA纯度。采用该方法对6个不同品牌的市售大豆卵磷脂产品进行转基因成分(CAMV35S启动子及NOS终止子)检测,结果证实均不含转基因成分。     

可视化膜芯片检测转基因大豆的研究

目的研究可视化膜芯片技术对转基因大豆及其制品的检测能力,验证该技术的灵敏度及可行性。方法利用可视化膜芯片对转基因大豆及其制品进行检测,并采用行业标准要求的实时荧光PCR方法进行对比验证。结果该技术具备典型外源基因片段的判定能力,能够用于大豆及其制品中转基因成分的检测,方法检出限为0.1%,比对验证实际样品的检测结果与行业标准荧光PCR法一致。结论该技术便捷、直观、准确,可用于大豆及其制品的转基因成分快速初筛与鉴定。     

实时浊度LAMP法检测豆制品中转基因成分

通过设计转基因大豆内源基因(Lectin)、外源基因NOS和2个转基因大豆品系(GTS 40-3-2,MON89788)特异性LAMP引物,建立快速检测转基因大豆以及鉴定转基因大豆品系的LAMP体系,并选取国内豆制品利用CTAB法进行DNA提取,并针对上述基因进行PCR和LAMP扩增的对比,建立起了检测大豆制品中转基因成分的定性的LAMP方法。结果表明:4个LAMP方法均有较好的特异性,除了NOS、GTS 40-3-2的检测限为0.1%外,其他LAMP方法的灵敏度为0.01%,均能满足实际检测要求;在实时浊度LAMP法检测大豆制品转基因成分的鉴定中,传统的CTAB法能成功提取大豆粗加工制品的DNA,且DNA纯度能够进行核酸扩增反应。利用转基因外引物进行的普通PCR结果与实时浊度LAMP结果是一致的,说明建立的转基因实时浊度LAMP检测方法有很好的准确性。     

马铃薯及其制品中转基因成分的多重PCR检测

采用CTAB法提取15个马铃薯及其制品样品中的总DNA,内源PATA基因的PCR扩增结果均为阳性,表明已提取到DNA。应用根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(nos)终止子和大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(nptⅡ)基因的二重PCR对样品进行转基因成分检测,结果均为阴性。将马铃薯DNA和阳性质粒pBI121混合作为PCR的反应模板,建立了内源PATA基因、花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S启动子、nos终止子和nptⅡ基因之间的多重PCR检测方法。多重PCR方法具有节约试剂、节省时间等特点,在转基因产品检测上的应用值得推广。     

应用PCR技术检测掺假肉类

目的建立5种动物源性成分的普通PCR检测方法,4种动物源性成分的实时荧光PCR检测方法,为食品安全服务。方法提取各肉制品的基因组DNA,合成PCR检测引物和荧光探针,优化反应条件和反应体系建立各动物源性成分的检测方法,分析市场上肉类掺假状况。结果建立了几种动物源性成分的检测方法,根据已建方法对保定辖区采集的样品进行检测,羊肉制品56份,掺假率为75%;驴肉制品15份,掺假率为6.7%;牛肉制品5份,掺假率为20%;兔肉制品2份,掺假1份。这些结果表明辖区市场上存在较多的肉类掺假问题,尤其是来自自由市场和烧烤摊的样品,掺假现象严重损坏了消费者的权益。结论建立的PCR检测方法获取DNA快速,检测灵敏度可以达到pg或fg级别,适用于大量肉制品的检测。     

五重PCR检测转基因大豆

旨在建立一套准确、快速、可靠的用于转基因大豆检测及DNA提取方法;以35S启动予(Cauliflowermosaicvirus 35S, CaMV 35S)、Nos终止子(Nopalinesynthase, Nos)、NPTⅡ、CP4-EPSPS四种外源基因和大豆内源基因(Lectin)为检测的目的片段,建立五重PCR反应体系,并采用改进的方法提取DNA,进行PCR扩增,实际检测了已知转基因大豆和市售大豆;改进的DNA提取方法与经典的CTAB方法相比,提取时间至少缩短了1h,降低了提取成本.经过PCR扩增对五种外源基因进行了检测,经DNA测序证实了产物为目的扩增产物.转基因大豆的检出限为0.2%～0.5%.改进后的DNA提取方法能够快速提取用于PCR扩增的高质量模板,消除了PCR反应的抑制因子;建立的五重PCR反应体系能够高效、准确的检测转基因大豆.     

基于SYBR Green Ⅰ熔解曲线分析的食品中转基因检测方法

研究建立了一种基于SYBR Green Ⅰ的实时荧光PCR方法,结合熔解曲线分析及位点特异的Tm值辅助判断,可以对不同加工类型及加工程度的食品进行转基因检测。该方法对NOS终止子,RRS,Bt176三个基因位点的检出限达到0.1%,对CaMV35S启动子基因位点的检出限可以达到0.05%。运用该方法对80例不同类型的样品进行检测,检出8例含有转基因成分,其检测结果与传统定性PCR方法和Taqman探针实时荧光PCR方法的结果相符。该方法是一种操作安全方便、成本较低、特异、灵敏的实时荧光PCR方法,适用于食品中转基因成分的定性检测。     

PCR法检测大豆加工食品中的转基因成分

通过分子生物学手段,以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,建立了检测大豆加工食品中转基因成分的方法。实验分别采用CTAB法和试剂盒(Kit)法对大豆锅巴、豆浆、豆奶粉、豆腐、豆腐丝等五种大豆加工食品中的DNA进行了提取,用内标基因Lectin对此两种方法的提取效果进行了比较,并以提取的DNA为模板,利用不同的引物分别对目标基因35S和NOS进行了PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明:Kit法的DNA提取效果优于改良CTAB法,上述五种大豆加工食品中均检测出35S启动子和NOS终止子,且均含有转基因成分。     

实时荧光定性聚合酶链式反应标准方法检测转基因产品的验证及应用

目的验证实验室大豆、玉米和水稻及其制品转基因检测方法,并应用于实际样品检测。方法根据GB 19495.4-2018《转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法》要求对无转基因标识的样品进行转基因成分检测。结果方法验证满意。40批次样品(大豆、玉米和水稻及其制品)中发现1批次的转基因成分检出,检出率为2.5%。结论市场中绝大部分未标示转基因成分的大豆、玉米和水稻及其制品确实未检出转基因成分,仅有极少数产品含有转基因成分,但未进行有效标识。