浓香型白酒糟醅微生物分离方法初探

快速而准确地分离糟醅中的各种微生物是进行浓香型白酒发酵机理研究的关键所在.主要从微生物分离的方式、稀释梯度的选择、抗生素的添加等方面介绍了快速分离白酒糟醅中好氧细菌、酵母和霉菌的方法.     

浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中酵母菌菌群研究

充分解析并挖掘浓香型白酒糟醅中的酵母菌株资源,对五粮液发酵旺盛期中的糟醅进行高通量测序以及纯培养。其中通过高通量测序技术共检测出11个种属的酵母菌群,包括:Kazachstania exigua、Saccharomyces cerevisiae、Kazachstania humilis、Pichia kudriavzevii、Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycopsis fibuligera、Trichosporon ovoides、Debaryomyces hansenii、Naumovozyma castellii、Pichia manshurica、Geotrichum silvicola。利用7种培养基筛选五粮液发酵旺盛期糟醅中的酵母菌株,通过合并共获得57株纯培养酵母菌株,通过26S rDNA序列鉴定,发现其分属于Pichia kudriavzevii、Saccharomyces cerevisiae、Candida glabrata和Candida rugosa。结果表明:浓香型白酒发酵旺盛期糟醅中的酵母群体多样性丰富,但与高通量测序相比,纯培养法仅能分离到糟醅酵母群体中的少数种属,因此要充分挖掘浓香型白酒糟醅中的酵母菌株资源,还需进一步优化分离、培养方法。     

不同季节对浓香型白酒发酵的影响

通过连续跟踪浓香型白酒糟醅在不同季节发酵过程中糟醅温度、理化指标和微生物的变化规律,并对不同季节下的白酒酒样进行理化检测和感官评价,研究不同季节下浓香型白酒产质量的变化规律。     

不同入窖酸度对浓香型白酒发酵的影响

对不同入窖酸度的浓香型白酒糟醅进行研究,并分析了发酵过程中的糟醅理化参数和出窖糟醅的感官品质,结果发现,不同入窖酸度对浓香型白酒糟醅的发酵参数影响较大,其中入窖酸度在1.8～1.9间的窖池的各理化指标都明显优于其他几个窖池,且出窖糟的感官质量较好,为入窖酸度的优化研究提供理论基础。     

高通量测序技术分析浓香型白酒酒糟自然堆积发酵过程的微生物多样性

通过第三代高通量测序技术对浓香型白酒酒糟堆积发酵过程中的细菌、真菌进行全面的测序分析,从而解析堆积不同时间节点的微生物群落变化规律。结果表明：堆积过程中,7个时间节点分别检测到125个、34个、72个、52个、30个、35个、47个细菌属,48个、16个、26个、23个、24个、30个、28个真菌属。自然堆积发酵过程中细菌优势菌属是芽孢杆菌,占比最高达到86.22%;此外,Tuberibacillus、醋酸杆菌属（Acetobacter）的占比也较高,相对丰度最高分别达到33.46%、15.79%。真菌优势菌属是嗜热菌属,在发酵中后期中稳定存在,占比大于40%;此外,棒孢酵母属（Clavispora）和丝衣霉菌属（Byssochlamys）的占比也较高,相对丰度最高达到77.40%、83.86%。该结果为深入研究和制备可高效发酵利用浓香型白酒酒糟的功能微生物提供了数据参考。     

四川浓香型白酒糟醅理化因子的产区特征解析

四川作为浓香型白酒的主要产地,在全国白酒产业中一直占据着重要地位。为解析四川浓香型白酒糟醅发酵过程中理化指标的产区特征,对比分析了泸州、宜宾和德阳三个代表性地区中浓香型白酒发酵过程糟醅的水分、酸度、淀粉、还原糖和酒精含量的变化。研究结果表明,相比较泸州和德阳地区,宜宾地区的糟醅在发酵过程中水分、酒精度、淀粉和还原糖的利用率都最高,而酸度较低。泸州地区发酵糟醅中整体水分和酒精度含量、淀粉和还原糖的消耗量都较低,仅酸度相对较高。德阳地区发酵糟醅的各项理化指标则介于宜宾和泸州地区之间。主成分分析也表明三个地区在浓香型白酒发酵过程中存在显著差异。本研究揭示了四川各产区浓香型白酒糟醅发酵过程中各理化因子的变化规律,为今后在实际生产中实现发酵过程的科学精准调控提供理论依据。     

浓香型白酒发酵过程中酒醅微生物群落结构解析及其与风味物质的相关性

以浓香型白酒连续发酵的酒醅样品为研究对象,基于高通量测序技术分析白酒发酵过程微生物群落组成及动态变化,采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）法测定酒醅样品中的挥发性风味物质,并分析微生物群落与风味物质的相关性。结果表明,发酵过程中酒醅样品细菌的丰富度和多样性高于真菌,厚壁菌门（Firmicutes）和子囊菌门（Ascomycota）分别是丰度最高的优势细菌门和真菌门。平均相对丰度大于1%的优势细菌属有乳杆菌属（Lactobacillus）、蚤蝇属（Levilinea）和普雷沃菌属（Prevotella）等;优势真菌属有酵母菌目的未分类属（unclassified Saccharomycetales）、嗜热真菌属（Thermomyces）和曲霉属（Aspergillus）等。微生物与主要风味物质的相关性研究发现,在浓香型白酒发酵过程中,与主要风味物质相关的微生物包括8 个菌属,分别为Thermomyces、Naumovozyma、酵母属（Saccharomyces）、Lactobacillus、醋酸杆菌（Acetobacte）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、假丝酵母属（Candida）和Aspergillus。     

模糊数学法评判不同糠用量对浓香型白酒发酵的影响

研究了不同糠壳用量对浓香型白酒糟醅发酵过程中水分、酸度、淀粉、酒精含量和微生物生长的影响规律.利用模糊数学法对出窖糟醅进行评判,结合酒样感官评价,以确定最佳糠用量.     

浓香型白酒窖池中细菌群落结构的研究

为探究浓香型白酒窖池中细菌群落结构和多样性变化，采用HiSeq高通量测序技术，对6个窖池样品中的细菌16S rRNA基因V3～V4区进行测序分析，比较了窖泥和酒醅中的细菌物种组成和丰度，解析了窖泥和酒醅中共有的细菌物种和关键差异物种，探究了浓香型白酒窖池中潜在的关键细菌菌种。研究结果表明，3个窖泥样品共注释到1 009个OTUs,主要分布于厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidete),其中厚壁菌门菌株的丰度超过了60%;3个酒醅样品共注释518个OTUs,主要分布于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。窖泥样品中的细菌物种总数和多样性均高于酒醅样品，窖泥样品中关键的细菌菌种主要来自梭菌属(Clostridium IV)、岩石单胞菌属(Petrimonas)、沉积物棒菌属(Sedimentibacter)、嗜蛋白菌属(Proteiniphilum)和喜热菌属(Caloramator);酒醅样品中关键的细菌菌种主要来自乳杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propioni...     

浓香型白酒窖池糟醅原核微生物区系的分类研究

为了探讨中国传统白酒窖池糟醅中的原核微生物区系的构成及变化，运用PCR扩增技术和16SrDNA序列同源性分析等方法测定糟醅中原核微生物的16SrDNA基因全序列，根据与基因数据库中相似菌群16SrDNA序列的同源性，分析窖池糟醅中原核微生物的生理特性和区系分布。结果发现，发酵60d的浓香型白酒糟醅中，真细菌主要分为6个菌群：低GKmol％革兰氏阳性菌、高G Cmol％革兰氏阳性放线菌群、革兰氏阴性拟杆菌群、革兰氏阴性变形杆菌群、革兰氏阳性纤毛菌群和耵Ⅵ7门，其中β-变形杆菌群约占窖池糟醅中原核微生物的80％；古菌主要为产甲烷古细菌，包括Methanoculleus群和Methanospirillum群。通过不同窖池的比较分析得出，微生物的多样性与窖池微生态密切相关。     

预处理对基于扩增子测序技术酒醅微生物菌群结构的影响

磷酸盐缓冲液(PBS)常被用作酒醅预处理,但目前对于预处理前后酒醅菌群结构的改变尚不清晰。采用扩增子测序技术对比分析预处理前后的2种酒醅(酱香型、浓香型)微生物菌群结构变化。结果表明,PBS预处理后两种酒醅真核微生物物种丰度显著增加而原核微生物显著减少(P<0.05),物种种类上无显著改变(P>0.05)。优势真菌及细菌在门水平上组成和相对丰度上均变化较小,但在属水平上组成和相对丰度有明显改变。预处理前后酱香型酒醅真菌属组成相似而细菌属组成有差异;浓香型白酒酒醅真菌属和细菌属均有差异。因此,预处理会在丰度水平上对酒醅微生物菌群结构造成影响,这进一步为酒醅、大曲、窖泥等发酵样品的预处理提供参考价值。     

浓香型白酒典型糟醅及其发酵影响因素研究进展

固态酿造生产浓香型白酒过程中,糟醅的质量直接影响到所产酒量和风味,而糟醅的质量又受各种因素的影响.介绍了浓香型白酒酿造过程中3种典型糟醅,即产酒糟醅、产酯糟醅和产酸糟醅,并介绍其感官与理化指标,以及影响糟醅产酒生香的各种因素.     

多粮浓香型白酒发酵过程中糟醅生物及非生物因子的变化规律

通过研究多粮浓香型白酒窖内发酵过程中糟醅理化指标(淀粉、还原糖、乙醇、总酸、总酯)和微生物菌群数量(细菌、酵母、霉菌)变化规律,发现发酵糟醅中各生物及非生物因子变化趋势明显不同,且各因子之间存在不同程度的相关性,其中细菌、霉菌、酵母的数量变化趋势差异明显,表明各类微生物对窖内非生物因子变化的响应情况有所不同。同一时期窖内不同层次糟醅理化及微生物指标亦存在细微差异,表明浓香型白酒窖内发酵过程中,窖内糟醅物质能量传递不够充分。总体上,多粮浓香型白酒窖内发酵规律稳定可循。     

1株Lodderomyces elongisporus酵母对浓香型白酒发酵的影响

为探究1株Lodderomyces elongisporus酵母对浓香型白酒发酵的影响,通过强化接种该酵母到固态发酵糟醅中发酵50 d,分析糟醅的理化指标、风味物质含量以及微生物区系的变化。结果显示,该酵母可使糟醅中还原糖含量显著增加,氨基态氮显著减少,乙缩醛、己酸生成量显著增加;且该酵母菌株大幅降低糟醅中真菌群体丰富度和多样性,强化接种的L.elongisporus取代原有优势真菌Zygosaccharomyces成为新的优势真菌,同时该酵母对细菌群体多样性影响相对较小,优势细菌Lactobacillus属丰度增加,Pseudomonas属丰度减少。结果表明,强化接种L.elongisporus酵母菌将改变浓香型白酒风味,且可对续糟发酵产生不可预知的持续影响。     

凤香型白酒生产阶段酒醅微生物群落结构分析研究

本研究利用高通量测序技术结合荧光定量PCR法,对凤香型白酒不同生产阶段的酒醅微生物群落结构进行分析,分离鉴定酒醅中的优势菌种。结果表明：各阶段出池酒醅中细菌的生物量在10⁷～10⁹ copies/g酒醅之间,真菌的生物量在10⁶～10⁸ copies/g酒醅之间,细菌的生物量高于真菌。酒醅中共检测到15个细菌门和6个真菌门,厚壁菌门Firmicutes和子囊菌门Ascomycota为绝对优势菌门;共检测到204个细菌属和140个真菌属,乳杆菌属Lactobacillus为绝对优势细菌属,毕赤酵母属Pichia、单孢酵母属Kazachstania、曲霉属Aspergillus、热子囊菌属Thermoascus、假丝酵母属Candida、德克酵母属Dekkera和纽曼菌属Naumovozyma为优势真菌属。分离鉴定得到36株细菌和25株真菌,其中3种细菌、5种真菌是酒醅中相对丰度排名前十的优势菌种。     

宜宾多粮浓香型酒厂内细菌多样性及分布的研究（二）

对宜宾多粮浓香型酒厂内生产过程环境中分离到的24株优势菌株进行DNA提取扩增测序,对其16SrDNA序列分析表明,其中13株为Bacillus属,9株分属于Lysinibacillus属、Staphylococcus属、Rummeliibacillus属,Brevibacillus属、Brachybacterium属,还有2株菌与数据库中模式菌株相似性低于97%,很可能代表着新类群.利用现代生物技术探索对酿酒相关细菌优势菌株的分子生物学信息,对浓香型白酒酿造过程中优势细茵区系的变化进行探索,探讨多粮浓香型白酒酿造过程中优势细菌对白酒风味物质的影响.     

浓香型白酒糟醅中酵母Geotrichum sp．的固态发酵特性

为了解Geotrichum sp.酵母在浓香型白酒糟醅中的生长特征及发酵功能,根据高通量测序结果,从浓香型白酒糟醅中分离到2株Geotrichum sp.酵母菌株,开展序列鉴定及生长代谢特征研究。研究发现,这2株酵母与地霉属4个种的26S r DNA序列相似性高于99%,对糖的利用情况类似Geotrichum sp.,但不能形成假菌丝,可耐受p H 4. 0及6%(体积分数)乙醇,在乳酸YPD液体培养基中的最适生长温度为28℃。在固态发酵糟醅中,2株酵母启动发酵较慢,但持续发酵能力较好,发酵24 d消耗淀粉的量分别是酿酒酵母的2. 2倍及1. 3倍,乙醇产量分别为7. 91和6. 71 m L/100 g,是其液态发酵产量的2. 5倍及4. 5倍,风味物质总产量分别为液态发酵的91倍及340倍,其中乙酸乙酯产量分别为1. 5和3. 0 g/kg,乙酸异戊酯产量分别为216和573 mg/kg,β-苯乙醇产量分别为658和477 mg/kg。结果表明,Geotrichum sp.酵母对浓香型白酒固态发酵糟醅适应良好,可长时间持续发酵,改善浓香型白酒花果香气,具有开发为新型白酒商业酵母的潜力。     

宜宾产区浓香型白酒酿造生境中细菌的群落结构

该文利用高通量测序技术全面解析宜宾产区浓香型白酒酿造生境中的微生物菌群结构,并对窖泥、大曲、酒醅和黄水中的细菌种类和丰度进行对比分析。结果表明,从宜宾产区白酒酿造生境的26个样品中共注释到来自于201个属的1493个OTUs,主要分布于拟杆菌门(Bacteroidete)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),其中5个属来自于古菌域的广古菌门(Euryarchaeota)。窖泥样品中微生物菌种的多样性最高,主要以古菌、瘤胃球菌和乳酸菌为主;大曲的多样性次之,主要包括未鉴定到属水平的细菌,芽胞杆菌、乳酸菌和高温放线菌等;酒醅和黄水中的微生物多样性最低,其主要微生物类群以乳酸菌和瘤胃球菌为主。宜宾产区浓香型白酒酿造过程微生物群落结构呈现出从多种微生物共同作用到功能微生物主要发挥作用的趋势。该研究为探究浓香型白酒酿造过程中功能微生物,解析白酒酿造机理,提升白酒品质奠定了基础。     

酱香型白酒第二轮次酒发酵过程微生物多样性研究

为探究酱香型白酒二轮次发酵过程中微生物群落结构的变化、微生物多样性以及物种与样品之间的关系,应用高通量测序技术对酱香型白酒第二轮次酒生产堆积及窖池发酵过程酒醅中微生物的多样性及其主要功能菌群进行研究。结果表明,在堆积过程中共检测到细菌138个属,真菌54个属;窖池发酵过程中共检测到细菌262个属,真菌267个属。酒醅中主要细菌类群为Firmicutes和Proteobacteria,主要真菌类群为Ascomycota和Basidiomycota。堆积过程中绝对优势细菌属有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus;绝对优势真菌属有Thermoascus、Thermomyces、Candida、Aspergillus。在窖池发酵酒醅中其绝对优势细菌属为Lactobacillus;绝对优势真菌属为Saccharomyces、Candida、Penicillium、Fusarium。由于堆积、窖池发酵酒醅所处发酵环境、发酵物料物态及其工艺参数差异较大原因,使得两者之间生物物种存在较大差异。     

浓香型白酒主要发酵产物生成与微生物类群的动态变化

为了探索浓香型白酒发酵过程中物质变化趋势,采用气相色谱分析和常规分析的方法,跟踪测定不同层次粮糟在不同发酵时间的主要代谢产物含量。研究表明:糟醅中乙醇、总酸、总酯含量与微量香味成分随着发酵时间的延长呈现一定的规律性;下层糟醅中的产物相应高于上层糟醅中产物;微生物类群数量的相对变化幅度为:酵母菌>细菌>霉菌;上层糟醅的霉菌、酵母菌与细菌的数量分别略高于其下层糟醅的霉菌、酵母菌与细菌数量。本研究初步揭示了浓香型白酒的发酵机理。