超声波联合酶解处理对β-伴大豆球蛋白抗原性的影响

试验以大豆分离蛋白为原料,选择超声波和酶解联合处理大豆蛋白,采用间接竞争ELISA法和免疫印迹法测定大豆主要抗原蛋白β-伴大豆球蛋白的抗原性和免疫活性,并分析超声波和酶解处理后大豆蛋白的结构变化。结果表明,超声波联合酶解处理能够显著降低β-伴大豆球蛋白的抗原性和免疫活性, 400 W、15 min超声波预处理的大豆蛋白质再经酶解处理后,β-伴大豆球蛋白的抗原抑制率降低了61.15%;电泳结果显示,超声波联合酶解处理能够使蛋白质肽键断裂,分解为小分子肽段;表面疏水性结果表明,蛋白质的空间结构发生解聚和重新聚合,三四级结构被破坏,构象型表位可能被改变。β-伴大豆球蛋白的抗原性的变化主要是因为超声波与酶解联合引起大豆蛋白氨基酸序列及空间结构的变化。     

糖基化改性对大豆蛋白抗原性及结构特性的影响研究

本文以大豆分离蛋白和葡聚糖为原料,在干热条件下进行美拉德反应,制取不同时间下的糖基化复合物。以β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白抗原抑制率为指标,采用间接竞争ELISA方法测定糖基化产物的抗原性,在反应6 d时,糖基化产物中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分别降低了31.94%和21.26%。糖基化产物颜色加深,且游离氨基含量降低,说明大豆蛋白与糖发生了不同程度的反应。红外光谱中糖链的引入,使蛋白质分子展开,β-转角和无规则卷曲结构含量的降低,影响了β-伴大豆球蛋白α亚基的抗原表位,从而可能使大豆蛋白的抗原性降低。糖基化反应影响抗原性的关键作用在于蛋白与糖结合部位对蛋白质结构的变化。     

糖基化改性对大豆蛋白抗原性及结构特性的影响

以大豆分离蛋白和葡聚糖为原料,在干热条件下进行美拉德反应,制取不同时间下的糖基化复合物。以β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白抗原抑制率为指标,采用间接竞争ELISA方法测定糖基化产物的抗原性,在反应6 d时,糖基化产物中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分别降低了36.90%和18.12%。糖基化产物颜色加深,且游离氨基含量降低,说明大豆蛋白与糖发生了不同程度的反应。红外光谱中糖链的引入,使蛋白质分子展开,β-转角和无规则卷曲结构含量降低,影响了β-伴大豆球蛋白α亚基的抗原表位,从而可能使大豆蛋白的抗原性降低。糖基化反应影响抗原性的关键作用在于蛋白与糖结合部位对蛋白质结构变化的影响。     

糖基化反应对大豆蛋白-乳糖复合物抗原性及结构的影响

本文将乳糖通过糖基化反应引入到大豆分离蛋白(SPI)上制备大豆分离蛋白-乳糖复合物,采用间接竞争ELISA法测定不同温度、不同质量比、不同反应时间下大豆分离蛋白-乳糖复合物中β-伴大豆球蛋白的抗原性变化,并对糖基化产物进行了结构特性的研究。结果表明,糖基化能有效降低β-伴大豆球蛋白的抗原性,其抗原性从93.79%降到37.75%。糖基化改性后,大豆蛋白中游离氨基含量降低,在反应60 h时,游离氨基含量下降最大;傅里叶红外光谱结果表明,与原大豆分离蛋白相比,大豆分离蛋白-乳糖糖基化产物的α-螺旋、β-转角、无规卷曲的含量下降,而β-折叠的含量增加;SDS-PAGE电泳及PAS染色结果表明,随着糖基化反应的程度增加,SPI谱带逐渐的减弱,说明SPI与乳糖分子发生了共价连接。     

低聚半乳糖糖基化对β-乳球蛋白诱导产生IgE的抑制作用

用低聚半乳糖对牛乳β-乳球蛋白进行糖基化处理,通过间接ELISA以及动物试验检测该结合产物的抗原性和免疫原性,结果表明糖基化处理能有效降低牛乳β-乳球蛋白的抗原性和免疫原性。通过动物试验和双抗体夹心ELISA方法检测牛乳β-乳球蛋白诱导产生IgE的量,结果表明低聚半乳糖糖基化对牛乳β-乳球蛋白诱导产生IgE具有显著抑制作用。     

加热联合酶解大豆7S蛋白的分子结构及抗原性研究

选用不同加热预处理条件、不同蛋白酶处理大豆7S蛋白,SDS-PAGE考察酶解后大豆7S蛋白的降解情况,间接竞争ELISA法考察酶解物的抗原性。结果表明:加热预处理联合酶解可显著增大β-伴大豆球蛋白的降解程度,β亚基消化程度得到极大提升,α亚基、α'亚基几乎完全被降解,在相同酶解时间下,胰蛋白酶的酶解速度快于胃蛋白酶;加热预处理联合酶解大幅降低了β-伴大豆球蛋白的抗原性,胰蛋白酶的效果优于胃蛋白酶,经80℃加热10 min预处理再经胰蛋白酶处理,大豆7S蛋白的抗原性降低了79.99%,而胃蛋白酶最优条件下最多仅降低50.4%; SDSPAGE结果表明,胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物中出现了抗消化肽段,经过质谱鉴定,均来自于β-伴大豆球蛋白的α亚基。     

大豆蛋白-木糖复合物的抗原性、致敏性及结构特性研究

大豆是营养丰富的植物蛋白资源,但也是八大过敏原之一;糖基化修饰是一种降低食物过敏原的有效方法。本文将木糖通过糖基化的方法引入大豆分离蛋白制备大豆分离蛋白-木糖复合物,采用间接竞争ELISA法,测定在一定温度、一定质量比、不同反应时间条件下,大豆分离蛋白-木糖复合物中大豆球蛋白的抗原性和过敏原性的变化,并且对糖基化产物进行了结构特性的研究。结果表明,糖基化能有效降低大豆球蛋白的抗原性和过敏原性,其抗原性从83.01%降到67.43%;过敏原性从46.32%降低到29.48%;两者在反应10 h时免疫活性都较低。通过三硝基苯磺酸(TNBS)法、SDS-PAGE电泳证明了糖基化反应的发生;傅里叶红外光谱结果表明,与大豆分离蛋白相比,SPI-木糖糖基化产物的α-螺旋、β-转角的含量下降,而无规卷曲、β-折叠的含量增加。     

有效降低牛乳β-乳球蛋白免疫原性的糖基供体研究

用低聚壳聚糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、壳聚糖和羧甲基壳聚糖对牛乳β-乳球蛋白进行糖基化处理,通过动物实验及ELISA方法检测各糖基化产物的抗原性和免疫原性,结果显示低聚半乳糖的糖基化处理降低牛乳β-乳球蛋白的抗原性和免疫原性效果最佳,分别降低41%和18%.凝胶过滤层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示,低聚半乳糖糖基化产物的相对分子质量为40kDa,保持原有的二聚体结构.该结合物与β-乳球蛋白比较,乳化稳定性、溶解性和分散性无显著性差异,而热稳定性和抗氧化性明显提高.以上结果表明,低聚半乳糖是糖基化法降低牛乳β-乳球蛋白免疫原性的较理想的糖基供体.     

碱性蛋白酶对β-伴大豆球蛋白抗原性的影响

选用碱性蛋白酶处理大豆分离蛋白,间接竞争ELISA法测定水解物中β-伴大豆球蛋白的抗原性,响应面法优化降低β-伴大豆球蛋白抗原抑制率的最佳工艺条件。结果表明,碱性蛋白酶可以显著降低β-伴大豆球蛋白的抗原性,在一定程度上,水解度与β-伴大豆球蛋白抗原抑制率呈负相关关系。碱性蛋白酶在酶解时间40 min、加酶量3 000 U/g、温度55℃、p H 8.5条件下,β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为33.48%,比大豆蛋白降低了64.16%。SDSPAGE结果显示,β-伴大豆球蛋白基本被酶解成小分子量肽段。     

反式肉桂酸对β-伴大豆球蛋白抗原性及结构的影响

为探究碱性条件（pH9.0）下反式肉桂酸（trans-cinnamic acid,TCA）对β-伴大豆球蛋白抗原性、抗原表位及蛋白结构的影响,利用间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法评估互作后蛋白与免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）及表位抗体的结合能力;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定蛋白分子量变化;利用紫外、荧光、红外光谱表征蛋白的结构变化。结果表明：在碱性条件下TCA与β-伴大豆球蛋白之间存在相互作用,且TCA可以降低蛋白的抗原性。互作后蛋白质的二、三级结构有显著变化,并降低了蛋白的表面疏水性,随着TCA添加浓度的增加,表面疏水性变化更加明显。     

The effects of ultra-high-pressure treatments combined with heat treatments on the antigenicity and structure of soy glycinin

Glycinin is one of the important allergens found in soybeans, which can potentially cause severe allergic reactions. Therefore, reducing the antigenicity of glycinin is of major significance to the research of soybean allergies. In order to detect the relationships between the antigenicity and structure of glycinin, samples were extracted from defatted soybean and then processed by ultra-high-pressure combined heat treatments. The processed proteins were determined using SDS-PAGE, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblotting, exogenous fluorescence, free sulfhydryl groups and Fourier transform methods. The results revealed that the antigenicity of the processed soy glycinin had decreased. In addition, the content levels of the hydrophobic groups, free sulfhydryl groups, α-helix, β-turn and random coils had increased, and the content of β-sheets had decreased. The results indicated that the reduction in the antigenicity of the glycinin was due to the processing treatments, which effectively destroyed the spatial structure of the glycinin.     

多酚氧化酶交联β-酪蛋白的抗原性变化初步研究

利用多酚氧化酶催化牛乳β-酪蛋白交联,并通过ELISA方法检测交联前后β-酪蛋白抗原性的变化。SDS-PAGE结果显示,多酚氧化酶可以有效地催化β-酪蛋白交联。同时,间接竞争ELISA检测的β-酪蛋白交联后的半抑制浓度(IC50值)由2.63μg/mL变为4.07μg/mL,表明交联后β-酪蛋白抗原性明显降低。本研究工作为通过多酚氧化酶交联制备低致敏性乳制品提供了部分理论依据。     

微生物发酵对豆粕抗原性的影响

探讨了微生物发酵对豆粕抗原性的影响。选用植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和米曲霉这5种菌株,在液态和固态条件下分别发酵豆粕12 h,对发酵产物进行抗原性测定。结果表明:豆粕经这5种菌株发酵后,粗蛋白含量均有所提高,其中枯草芽孢杆菌在固态发酵时降解豆粕抗原蛋白和降低豆粕抗原性的效果优于其它菌株,此时,豆粕蛋白水解度为4.89%,必需氨基酸含量为193.51mg/g。SDS-PAGE显示发酵豆粕中β-伴大豆球蛋白的α’和α亚基消失,β亚基条带和大豆球蛋白的酸性亚基条带密度减弱,同时大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白的抗原性降低率分别为20.62%和50.12%。     

热处理对大豆11S球蛋白溶解性和二级结构的影响

采用差示扫描量热仪、Lowry法以及傅里叶变换红外光谱法分别对大豆11S球蛋白的热性质、溶解性和二级结构进行测定与分析,研究热处理对11S球蛋白溶解性和二级结构的影响。热处理能够使大豆11S球蛋白Td和ΔH降低,导致蛋白质发生部分或完全变性。80?℃热处理使大豆11S球蛋白的溶解性降低,这可能由于热处理改变了蛋白质的空间结构和表面电荷所致,此时蛋白质的α-螺旋结构逐渐转变为β-折叠和无规卷曲结构。而90?℃和100?℃热处理一定时间后,蛋白质溶解性又稍有升高,这可能是形成可溶性聚集体造成的。此时蛋白质的α-螺旋和β-折叠结构向β-转角和无规卷曲结构转变,表明β-转角和无规卷曲结构对热聚集体的形成具有重要作用。此外,蛋白质变性和氢键断裂是导致二级结构相互转变的重要因素。     

还原协同加热处理对花生过敏原Ara h2结构及抗原性的影响

花生过敏能引起荨麻疹、呕吐甚至休克等症状,通常是终生性过敏。本研究运用加热处理、半胱氨酸还原对Ara h2进行单独和复合处理,采用圆二色谱、紫外扫描光谱、间接竞争酶联免疫吸附法分别检测蛋白加工前后的结构与抗原性变化。结果显示,单一的加热和半胱氨酸还原处理过的蛋白结构与抗原性只发生部分变化。而复合处理中,在加热条件下,半胱氨酸还原蛋白的能力明显增强,还原后的蛋白二级结构与三级结构发生大幅变化,抗原性显著降低。研究结果表明,二硫键对于蛋白Ara h2结构稳定具有重要作用,二硫键被还原和加热过程破坏后,蛋白的抗原性和结构即发生重大变化。还原协同加热处理有望大幅改善2S球蛋白的结构和致敏性,可以作为蛋白脱敏加工的备选方法。     

牡蛎致敏蛋白初步分离和酶解处理对其抗原性的影响

分离获得太平洋牡蛎致敏蛋白,考察酶解法对牡蛎致敏蛋白抗原性的影响。方法 利用硫酸铵沉淀和葡聚糖凝胶G-75分离牡蛎致敏蛋白,聚丙烯酰胺电泳分析获得蛋白的分子量大小,使用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和动物蛋白水解酶(3 000 U/g)酶解牡蛎致敏蛋白,OPA法测定水解度,间接竞争ELISA法测定酶解产物的抗原性。结果 分离到分子量约为40和98 kD的牡蛎致敏蛋白,经木瓜蛋白酶酶解的致敏蛋白特征条带消失,酶解产物水解度为(31.87±0.309)%,动物蛋白酶和中性蛋白酶对牡蛎致敏蛋白水解度分别为(24.13±0.153)%和(12.43±0.115)%,但致敏蛋白特征条带未完全消失;间接竞争ELISA检测表明3种蛋白酶均能不同程度地降低牡蛎致敏蛋白的抗原性或使致敏性基本消除。结论 蛋白酶酶解法可有效水解牡蛎致敏蛋白,从而降低其抗原性,其中木瓜蛋白酶效果明显。     

聚乙二醇修饰β-乳球蛋白羧基对其抗原性和结构的影响

采用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）对β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-LG）羧基共价修饰,探究PEG修饰及PEG化程度对β-LG抗原性和结构的影响。结果表明：总修饰率为82.91%;使用SP?Sepharose?Fast?Flow阳离子交换柱分离纯化,获得纯度分别为99.66%和98.61%的两种主要修饰产物;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定产物分子质量分别为23.3?kDa和28.6?kDa,为单修饰产物（mono-PEG-β-LG）及两点修饰产物（di-PEG-β-LG）。β-LG、mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的间接竞争酶联免疫吸附测定半抑制浓度（IC50）分别为1.90、2.47?μg/mL和10.41?μg/mL;mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的IC50分别是β-LG的1.30?倍和5.48?倍,表明提高PEG修饰程度可极显著降低β-LG的抗原性。mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG的游离巯基含量分别为42.70?μmol/g和37.97?μmol/g,表明PEG化程度增强,遮蔽作用增强。表面疏水性和内源荧光分析表明,mono-PEG-β-LG只发生了三级结构变化,而di-PEG-β-LG二级结构水平同时发生变化,表明PEG修饰后β-LG空间结构的改变可能是导致其构象表位破坏和抗原性下降的因素。PEG分子遮蔽可能是导致修饰产物抗原性降低的另一原因。PEG共价修饰β-LG可以显著降低后者的抗原性,且随PEG化程度增大β-LG抗原性降低幅度增加。     

Carbohydrate moieties on the in vitro immunoreactivity of soy β-conglycinin

β-Conglycinin is a functional glycoprotein and one of the most important soybean allergens. The aim of the present research was to investigate the role of the N-glycans moieties of β-conglycinin on its in vitro immunoreactivity. The soy allergen was obtained by isoelectric precipitation from commercial soy protein isolate and was enzymatically deglycosylated by PNGase F (Peptide N-Glycosidase F EC 3.5.1.52). In order to optimize deglycosylation conditions different reaction times and allergen concentrations were tested. The extent of deglycosylation was estimated by SDS–PAGE, CZE, RP-HPLC, and MALDI-TOF MS analyses, which provided information related to changes in protein structure. The antigenicity of both native β-conglycinin and its deglycosylated form was evaluated by western-blotting and indirect ELISA employing polyclonal rabbit anti-soybean sera and horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG while the in vitro allergenicity was assessed by means of indirect competitive inhibition ELISA employing human sera (IgE) of soy allergics. β-Conglycinin was effectively deglycosylated by PNGase F. Data on immunological tests suggested that glycosyl moieties forming this glycoprotein might be involved in its immunoreactivity.     

超声处理对牛乳酪蛋白结构及抗原性的影响

利用超声波处理牛乳致敏蛋白α-酪蛋白（casein,CN）和β-CN,结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、圆二色光谱、荧光光谱及酶联免疫吸附测定等方法分析α-CN和β-CN结构和抗原性的变化。结果表明：随着超声波功率的增大,α-CN的分子质量无显著性变化,β-CN在600 W时发生聚集,两种酪蛋白羰基含量上升,自由巯基含量先下降后回升,在500 W时达到最低,疏水性则呈现与自由巯基含量相反的规律;二级结构中,α-螺旋结构经超声处理后其相对含量减少,无规卷曲相对含量随着超声功率先增加后降低,功率为500 W时相对含量最高,β-折叠的相对含量变化趋势则与无规卷曲相反,这表明超声波处理破坏了酪蛋白的高级结构;随着超声功率的增强,抗原性呈现先升高后降低的趋势,其中500 W时抗原性最高,与酪蛋白疏水性及无规卷曲结构相对含量呈正相关,与β-折叠结构的相对含量呈现负相关。超声处理酪蛋白在影响蛋白构象及结构的同时改变其抗原性,且抗原性与疏水性及无规卷曲相对含量相关。     

黑木耳多糖-乳清蛋白复合物的制备及其抗原性的研究

蛋白质和多糖在控制条件下通过美拉德反应会发生一定程度的共价复合,能显示更优越的性能。采用黑木耳多糖作为糖基供体,用糖基化的手段与牛乳中乳清蛋白结合形成木耳多糖-乳清蛋白复合物,并在现有的条件下探索不同质量比与不同反应时间对糖基化进程的影响,采用间接竞争ELISA法测定复合物中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白抗原性的影响。结果表明,乳清蛋白与黑木耳多糖质量比为1：1,反应时间为24h,是糖基化反应最佳条件并且能有效减低乳清蛋白抗原性,其中β-乳球蛋白抗原性降低率为75.7%,α-乳白蛋白抗原性降低率为25%。