基于基因测序鱼露发酵橘青霉YL-1鉴定及安全性评价

目的：为弥补传统方法在检测菌株产毒素上的不足,用基因组方法分析橘青霉YL-1（Penicillium citrinum YL-1,P. citrinum YL-1）物质生物合成途径及关键基因,以此评价P. citrinum YL-1在鱼露发酵生产过程中的安全性。方法：应用ITS基因测序鉴定菌株,利用Illumina平台Hiseq测序技术对菌株YL-1进行基因组survey测序,通过生物信息分析产青霉毒素、黄曲霉毒素及典型丝状真菌毒素的非核糖体多肽合成代谢、聚合酮酶代谢、聚合酮酶-非核糖体多肽联合代谢、萜类化合物代谢和氨基酸相关代谢途径及基因,考察菌株YL-1产真菌毒素能力,判断其是否存在产真菌毒素的潜在危害。结果：ITS鉴定菌株YL-1与P. citrinum同源性99%,survey测序结果表明P. citrinum YL-1全基因组大小为31.92?Mb,GC为46.27%。利用Maker2基因预测技术得到预测基因11?980?个。其中,被KOG注释基因5?417?个,被COG注释基因4?946?个;比对KEGG数据库被注释通路323?条,注释基因3?525?个。代谢分析表明,注释到可能产真菌毒素相关的代谢途径有5?条,仅注释到1?种产黄曲霉毒素代谢途径的同源基因Afld及其他5?种相关基因,但并未注释到其完整代谢途径。结论：ITS基因测序鉴定菌株YL-1为P. citrinum,P. citrinum YL-1基因注释存在1 种产黄曲霉毒素的同源基因及其他5?种相关基因,虽不存在完整代谢链,但P. citrinum YL-1运用于鱼露及相关产品的发酵安全性仍值得进一步考察。     

风干肉中产脂肪酶瑞士乳杆菌TR13全基因组测序及序列分析

瑞士乳杆菌TR13是从自然风干羊肉中分离筛选到的1株产脂肪酶活性高的菌株,为能够更好地研究该菌株在羊肉发酵过程中的代谢机理和功能,采用PacBio Illumina HiSeq测序平台对细菌TR13进行完成图测序分析。结果表明,瑞士乳杆菌TR13基因组为1套环状无质粒分子,基因组序列总长度为2 172 224 bp,GC含量为36.82%。基因组中预测到2 536个编码基因,编码基因总长度为1 883 532 bp,平均长度为799.46 bp,平均密度为1.08个/kb,对应蛋白质平均序列长度为265 aa,占基因组百分比为86.71%。TR13菌株基因组中包含15个rRNA操纵子和63个tRNA。预测到可能的毒力基因75个,耐药基因150个。编码基因通过GO、COG和KEGG数据库的对比分析,完成了TR13菌株基因组基本功能注释和代谢通路基因信息注释,注释信息可为菌株应用研究提供一定理论依据。     

酱香大曲中3株放线菌的分离筛选及挥发性成分分析

为探究酱香大曲中放线菌的种类及功能,建立了一种有效的放线菌分离筛选方法,并通过此方法在28 ℃培养条件下,从茅台大曲中分离出了3株放线菌,对其进行形态学特征、生理生化实验及分子生物学鉴定,并对菌株的产酶、产香特性进行了研究。结果表明,FBKL4.001、FBKL4.002鉴定为可可链霉菌（Streptomyces cacaoi）、FBKL4.003鉴定为沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus）,3株菌产果胶酶能力较为突出,分别为299.66 U/g、216.52 U/g、294.86 U/g,其固态发酵挥发性成分以酯类物质为主,分别占62.80%、59.23%、46.77%,且均能产生吡嗪类物质。     

酱香型大曲中具产酶功能霉菌的分离筛选

目的:从酱香型大曲中筛选功能菌。方法:从贵州省某酒厂的酱香大曲中分离到19株霉菌,测定了各菌株的液化酶、糖化酶和蛋白酶活力。结果:筛选到两株同时产液化酶、糖化酶和蛋白酶三种酶活都相对较高的菌株,对两株菌进行鉴定,并构建系统进化树,经鉴定两株菌分别为谢瓦散囊菌FBKL3.0004和阿姆斯特丹散囊菌FBKL3.0013。结论:筛选的两株菌能够应用于白酒酿造。     

1株产VB12球形赖氨酸芽孢杆菌C5.1的分离、全基因组测序及分析

为深入探究球形赖氨酸芽孢杆菌C5.1(LysinibacillussphaericusC5.1)菌株产VB₁₂的作用机制,利用PacBio Sequel和Illumina NovaSeq PE150相结合的方法对C5.1菌株进行全基因组测序,并对测序数据进行拼接、基因预测及功能注释。结果表明,C5.1菌株基因组为一个环状DNA,不含质粒,大小为4 690 817 bp,GC含量为37.21%,预测得到4 756个编码基因,111个tRNA基因和34个rRNA基因。通过基因本体论、直系同源集、京都基因与基因组百科全书和转运蛋白分类数据库对C5.1菌株基因组进行注释分析,分别匹配到3 095、3 182、4 374个和397个基因。进一步分析发现C5.1菌株基因组中包含从尿卟啉原Ⅲ逐步转化合成VB₁₂的关键酶。本研究为解析C5.1菌株在臭腐乳发酵过程中的代谢机理提供遗传信息基础,也为今后开展发酵食品中VB₁₂的生物合成机制研究提供理论支撑。     

基于高通量测序对茅台镇酱香白酒主酿区霉菌菌群结构多样性的解析

为系统性研究茅台镇主酿区生产大曲和酿造环境霉菌菌群多样性结构,基于MiSeq平台采用高通量测序技术对茅台镇酱香白酒7?个主酿区大曲和环境样品霉菌进行解析,共检出霉菌95?个属,其中从大曲样品中检出68?个属,环境样品中检出89?个属。明确了Aspergillus、Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces、Rhizomucor等属是酱香白酒酿造大曲中的优势霉菌;Alternaria、Aspergillus、Byssochlamys、Cladosporium、Fusicolla、Lecythophora、Monascus、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Thermoascus、Thermomyces、Toxicocladosporium等属是酱香白酒酿造环境中的优势霉菌,通过对各主酿区之间霉菌差异性分析、主酿区生产大曲和酿造环境之间霉菌差异性分析,对比霉菌在各区域多样性指数、富集率、衰减率和迁移率变化,深入剖析了不同主酿区酿造大曲与周围环境霉菌的交互程度,从微生物角度为酒厂的选址提供一定理论依据。     

高温大曲中产酱味霉菌的分离及研究

从高温大曲中分离得到几株霉菌,通过研究形态、理化特性并结合感官评定及挥发性物质的检测,从而确定该霉菌菌株可产酱味,为研究霉菌代谢物质与酱香味生成之间的关系提供依据。     

酱香型大曲中高温放线菌的筛选及风味成分分析

从高温酱香型大曲中分离得到一株耐热性良好的放线菌FBKL4.010,通过形态学、生理生化特征鉴定、16S rRNA基因序列分子生物学鉴定,确定该菌株归属于高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae）莱斯氏菌属（Laceyella sp.）,经过进一步系统发育学比对分析鉴定为1?株糖莱斯氏菌（Laceyella sacchari）,其最适生长温度为45?℃;同时针对白酒酿造体系设计纯种菌株固态发酵实验,采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术分析菌株挥发性代谢产物,结果表明,该菌株在固态发酵体系下能够代谢产生大量吡嗪类、芳香类物质,为发酵液赋予特征性豆豉、坚果风味,其中四甲基吡嗪占总挥发性成分的43.318%,其被认为是酱香白酒风味的主体成分之一,为日后深入探究该菌株在酱香风味形成中的作用提供了理论支持。     

基因组功能注释分析米曲霉ZA189优势酿造性能的遗传基础

米曲霉ZA189是以米曲霉沪酿3.042为出发菌株经传统诱变获得的,具有中性蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶活力高的特性。为深入研究米曲霉ZA189的遗传背景,评估其作为酱油酿造菌株的性能,本研究利用新一代纳米孔测序技术完成了米曲霉ZA189基因组的测序、组装和功能注释。获得的基因组全长36.89 Mb,包含16条Scaffold,测序深度达到132.05×。基因注释表明,米曲霉ZA189基因组包含263个t RNA基因和72个r RNA基因,这是米曲霉高效表达蛋白的遗传基础。KOG和KEGG注释表明米曲霉ZA189具有强大的能量合成、蛋白质合成及次级代谢产物合成能力,这是其在发酵工业广泛应用并产生多种风味功能物质的遗传基础。碳水化合物活性酶CAZy注释和蛋白酶注释表明,米曲霉ZA189基因组中包含多达330个糖苷水解酶(GH)和30个蛋白酶基因,这是米曲霉ZA189作为酱油酿造菌株降解大豆蛋白和碳水化合物的关键性能指标。通过本研究对酱油酿造菌株米曲霉ZA189的基因组有了更加深入的理解,通过对蛋白表达系统基因、次级代谢基因、碳水化合物活性酶及蛋白酶的功能注释,为指导其在酱油酿造中的应用提供了理论支持。     

1 株来源于茅台酒酿造过程宛氏拟青霉MTDF-01的全基因组测序及分析

为深入了解宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）在酱香型白酒生产过程中代谢机理,为今后进一步挖掘及调控P. variotii在白酒酿造过程中代谢提供必要生物信息学基础。通过PacBio RS II测序平台对P. variotii MTDF-01进行全基因组测序,并且对测序数据进行基因组组装、基因预测和功能注释、碳水化合物基因预测、次级代谢产物合成基因簇预测,以及与已报道全基因组序列的分离于土壤中的耐甲醛P. variotii No.5进行比较基因组分析和共线性分析。基因组拼接得到19 个基因组骨架和19 个重叠群,总长度为30 833 540 bp,GC平均含量为47.46%。基因组中预测到8 815 个基因、5 044 个简单重复序列,221 个tRNA,49 个rRNA。总共注释基因8 662 个,其中淀粉和纤维素水解酶基因分别有60 个和165 个,次级代谢产物合成基因簇23 个。P. variotii MTDF-01与P. variotii No.5基因组存在翻转、异位等基因组重排,两者基因组共存在16 414 处单核苷酸碱基突变,其中有525 个碱基缺失,335 个碱基插入,15 554 个单碱基替换。本研究利用PacBio RS II测序平台获得了P. variotii MTDF-01的全基因组信息,并且分析P. variotii MTDF-01的潜在功能,为深入了解P. variotii在白酒生产过程中的代谢机理提供了遗传信息基础,对今后酱香型白酒中风味和健康物质的调控研究具有重要意义。     

茅台大曲中一株嗜热放线菌的分离筛选及特性研究

为探究茅台大曲中的放线菌的种类及功能,建立了一种有效的放线菌的分离筛选方法,并通过此方法在45 ℃培养条件下, 从茅台大曲中分离出了1株嗜热放线菌株FBKL4.004,对其进行形态学特征、生理生化实验及分子生物学鉴定,并对菌株FBKL4.004 的产酶、产香特性进行了研究。 结果表明,菌株FBKL4.004鉴定为Streptomyces bangladeshensis,该菌株产糖化酶和果胶酶能力较为突 出,分别为345.03 U/g及318.57 U/g,且其固态发酵产物挥发性成分中酯类物质相对含量最高（34.57%）,其次分别为萜烯类物质（18.51%） 及吡嗪类物质（17.63%）。     

酱香大曲中产四甲基吡嗪细菌的分离鉴定及其功能性研究

采用稀释平板涂布法从酱香型白酒大曲中分离筛选出细菌菌株19株,模拟酱香型白酒生产发酵工艺,获得2株固态发酵产物具有浓郁酱香气味的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201。结合菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法,鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。研究发现,菌株FBKL1.0199具有高产蛋白酶的特性,其中性蛋白酶活力达3 925. 80 U/g,酸性蛋白酶活力也相对较高,达139.27 U/g。同时,利用固相微萃取-气质联用技术对菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201模拟白酒固态发酵的挥发性香味物质进行分析,发现其中吡嗪类物质相对含量较高,分别为46.01%和48.32%,且均以四甲基吡嗪为主,含量分别为44.11%和47.41%。分离得到的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201可以作为产四甲基吡嗪的功能菌。     

酱香大曲中高产蛋白酶功能细菌的筛选及鉴定

通过对酱香型大曲中的细菌进行分离纯化培养,获得一株高产蛋白酶的菌株FBKL1.0199,然后采用菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法,鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。实验条件下该菌株所产中性蛋白酶高达3 925.80 U/g,酸性蛋白酶活力达139.27 U/g,为提高酱香型白酒品质研究奠定了基础。     

丝状真菌改善强化曲品质的研究

将几株课题组保存的丝状真菌进行糖化酶活力检测,挑选出1株高产糖化酶的丝状真菌分枝犁头霉FBKL3.0009。对丝状真菌FBKL3.0009、毕赤酵母FBKL2.0008与地衣芽孢杆菌FBKL1.0199进行不同接种比例的混种固态发酵实验,研究丝状真菌与混培养体系中酵母菌、地衣芽孢杆菌的互相作用。结果表明,丝状真菌的添加对细菌与酵母的生长影响不大,混合发酵体系中丝状真菌的生长越旺盛,糖化酶的活力也就越高,还原糖含量也会随之增加。对培养结束后的麦曲进行理化指标检测可知,与不添加丝状真菌发酵的麦曲相比,糖化力得到提高。对强化曲进行GC-MS风味物质分析,丝状真菌的添加对吡嗪类物质产生有抑制作用。     

酱香白酒酿造过程中产多元醇功能酵母的筛选

为了解酱香型白酒酿造过程中产多元醇酵母的种类和功能,以酱香型白酒大曲和酒醅中分离的酵母为研究对象,采用薄层层析法和高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）对具有产多元醇功能的酵母进行筛选和多元醇定性、定量分析。实验结果显示,从142株酵母菌中筛选出5株具有产多元醇功能的酵母菌娄德酵母（Lodderomyces elongisporus） FBKL2.0073、库得毕赤酵母（Pichia kudriavzevii） FBKL2.0008、Trichosporon coremiiforme FBKL2.0310、Trichosporon coremiiforme FBKL2.0307和Trichosporonoides sp. FBKL2.0315,其中前4株菌都能产D-阿拉伯糖醇,L. elongisporus FBKL2.0073菌株产多元醇的总量最多,为（9.87±0.85） g/L。     

产多元醇酵母对酱香型白酒发酵的强化应用

利用从酱香型大曲中和酒醅筛选出的德巴利酵母和Trichosporon coremiiforme提高酱香型白酒中醇甜风格特征。将FBKL2.0130(德巴利酵母)和FBKL2.0310(Trichosporon coremiiforme)添加到下沙堆积后酒醅中模拟窖池发酵,考察不同菌株添加量对酒醅中多元醇含量的影响,采用高效液相-蒸发光散射检测器对酒醅中多元醇含量进行测定,对酒醅中微生物生物量和理化指标进行分析。结果表明,发酵后酒醅中细菌和酵母数量为10²g^-1,未发现霉菌存在;接种量增加,会加快对原料中还原糖的利用;添加功能性菌株FBKL2.0130和FBKL2.0310均能使酒醅中多元醇含量增加,菌株FBKL2.0130接种量10%时,多元醇含量最高,为1.418 mg/g;菌株FBKL2.0310接种量12%时,多元醇含量最高,为1.461 mg/g。     

强化曲中毕赤酵母与地衣芽孢杆菌的相互作用研究

以实验室分离得到的毕赤酵母FBKL2.0008与产酱香风味的细菌FBKL1.0199作为主要菌种,用于强化麦曲的制备。设置了5个接种比例,30℃发酵14 d后,确定了最佳的接种比例为地衣芽孢杆菌∶毕赤酵母=1∶10。监测强化曲发酵过程中微生物生物量,酸性蛋白酶活,淀粉酶活变化情况,可知毕赤酵母的加入对地衣芽孢杆菌的生长与代谢产物的生成情况没有明显影响。强化麦曲风味物质中吡嗪类物质相对百分含量为19.286%,其中四甲基吡嗪相对百分含量为16.365%。