米曲霉3.951菌株与RIB40菌株高产原生质体的制备及再生条件的研究

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是:以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是:以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。     

Mass Preparation and Regeneration Conditions of Protoplast from AspergiUus oryzae AS 3. 951 and RIB40

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是：以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是：以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。     

灵芝原生质体制备与融合条件的研究

以美国大灵芝和信州灵芝为起始菌株,对其原生质体制备和融合条件进行研究。结果表明:美国大灵芝原生质体制备最佳条件:摇瓶培养4d的菌丝球,复合酶液酶解,温度31℃,时间3h,原生质体制备率为5.80×106个/mL,再生率为0.32‰;信州灵芝原生质体制备最佳条件:摇瓶培养5d的菌丝球,复合酶液酶解,温度31℃,时间2.5h,原生质体制备率为4.71×106个/mL,再生率为0.24‰。两种原生质体最佳融合条件:促融剂PEG浓度30%,Ca2+浓度0.03mol/L,时间30min,温度35℃,融合率0.47%。     

酿酒酵母和酒类酒球菌原生质体制备与再生的条件优化

应用正交设计，研究酶解时间、酶浓度和酶解温度对酿酒酵母和酒类酒球菌原生质体制备和再生的影响。实验结果表明，酶解浓度对原生质体制备和再生的影响最大。最优组织条件为当蜗牛酶浓度为20g/L，酶解温度为37℃和酶解时间为20min时，酿酒酵母原生质体的制备率为88.4%。再生率为32.5%。当溶菌酶浓度为1mg/mL、酶解温度为37℃和酶解时间为20min时，酒类酒球菌原生质体的制备率为87.5%，再生率为31.2%。     

复合酶酶解条斑紫菜工艺条件及优化

条斑紫菜是一种具有很高营养价值和多种活性物质的藻类。以酶解液中游离氨基酸含量为指标,结合酶配比、酶加量、pH值、酶解温度、酶解时间等因素,确定复合酶对条斑紫菜酶解工艺,并在此基础上进行条件优化。试验结果表明,条斑紫菜酶解优化条件:复合酶配比1:3:3,复合酶加量为条斑紫菜总量的0.8%,酶解温度为45℃,酶解时间为170min,pH值为6.5。经优化后条斑紫菜酶解液中游离氨基酸含量为0.541g/100mL。     

乳酸菌原生质体制备与再生研究

从市售酸乳中分离嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌,并对其进行原生质体制备和再生。采用溶菌酶对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行处理,脱去细胞壁以探讨原生质体形成和恢复与菌龄、酶浓度、酶解时间及酶解温度之间的关系,利用四因素三水平的正交试验选出原生质体形成和恢复较适宜的条件。试验结果显示嗜热链球菌原生质体制备和恢复的较优条件为,菌龄16h,酶浓度1mg/ml,酶解时间40min,酶解温度42℃,此时原生质体形成率为98.75%,再生率为23.8%;而保加利亚乳杆菌原生质体制备和恢复的较优条件为,菌龄16h,酶浓度10mg/ml,酶解时间30min,酶解温度36℃,此时原生质体形成率为82.05%,再生率为27.1%。本文研究为这两种乳酸菌原生质体的制备、再生条件及其基因操作和相关研究提供技术思路和实验条件。     

利用原生质体再生技术选育内切型菊粉酶高产菌株

利用原生质体制备与再生技术选育内切型菊粉酶高产菌株,以I200913作为出发菌株(酶活为0.413 u/m L),研究了在不同酶配比酶解液、不同酶解温度、不同酶解时间的条件下,对原生质体制备、再生以及内切型菊粉酶酶活的影响。研究结果表明,在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体形成率最高,为22.32%。在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体再生率最高,为16.02%。在酶配比为:纤维素酶0.7%+蜗牛酶0.2%+溶菌酶0.1%=1%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5h条件下,原生质体再生菌株内切型菊粉酶酶活最高为0.598 u/m L,比出发菌株提高了28%。     

桦褐孔菌原生质体制备与再生

研究桦褐孔菌原生质体制备与再生条件。采用正交试验法确定复合酶比例,用单因素试验测定不同等渗液、酶解时间、桦褐孔菌菌龄、酶解温度、再生培养基对桦褐孔菌原生质体制备与再生的影响。结果表明：混合酶(纤维素酶5mg/mL、蜗牛酶15mg/mL、溶壁酶15mg/mL、崩溃酶15mg/mL)、菌龄为7d的菌丝,采用0.6mol/L MgSO4为渗透压稳定液,酶解温度35℃,酶解时间5.5h,有利于原生质体的制备。就原生质体再生而言,酶解时间为3.5h制得的原生质体,以MgSO4作为渗透压稳定液,以完全再生培养基(CYM)和麦芽酵母葡萄糖再生培养基(GYM)有利于原生质体再生,再生率最高为0.13%。     

酶解制备冬枣汁的工艺条件优化研究

为提高冬枣汁的出汁率,采用复合酶(果胶酶∶纤维素酶=1∶1)对冬枣进行酶解.研究复合酶用量、酶解温度、酶解时间对冬枣出汁率的影响.在单因素实验的基础上,通过响应面法优化酶解制备冬枣汁的工艺条件.得到最佳工艺条件为:复合酶用量0.0156％、酶解温度29℃、酶解时间20.8min.在此条件下,出汁率达72.4％.表明酶解处理是提高冬枣汁出汁率的有效方法.     

粗壮脉纹孢菌原生质体的制备、再生及转化的条件

为建立原生质体介导的粗壮脉纹孢菌遗传转化系统,本研究主要考察了复合酶解液、菌龄及酶解时间对粗壮脉纹胞菌原生质体生成及再生的影响。结果表明,粗壮脉纹胞菌孢子悬液接种在马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar,PDA）液体培养基中,30 ℃条件下摇床培养10 h的菌丝,采用0.5 g/100 mL蜗牛酶＋0.5 g/100 mL溶壁酶＋1 g/100 mL纤维素酶的复合酶解液、30 ℃条件下酶解10 h,粗壮脉纹胞菌原生质体生成及再生最为适合。在此条件下,原生质体生成数可达4.53×106 个,38#再生培养基中的再生数可达1.41×106 个,再生率达31.71%,聚乙二醇介导PAKHB载体转化NC原生质体,每微克质粒可获得8 个以上的转化子。     

鞘氨醇单胞菌TP-3原生质体制备与再生的研究

研究了EDTA预处理、菌龄、溶菌酶浓度、酶解温度及酶解时间对鞘氨醇单胞菌TP-3原生质体制备与再生的影响。结果表明:10 mmol/L EDTA对菌体进行预处理,菌龄18 h,酶浓度60μg/m L,酶解温度32℃,酶解时间30 min时,菌株原生质体的形成率可达96.1%,再生率达32.2%。本文为进行原生质体融合选育优良微生物菌种奠定了基础。     

响应面法优化酥李果汁的酶法提取工艺

目的:研究酶解提取酥李果汁的最佳工艺条件,为李深加工利用提供理论参考。方法:以酥李出汁率为指标,在单因素实验基础上采用响应面试验优化,对单一果胶酶、单一纤维素酶、复合酶（果胶酶和纤维素酶）提取酥李果汁的工艺条件分别进行优化。结果:不同加酶方式中对酥李出汁率的影响因素顺序均为酶解温度>加酶量>酶解pH>酶解时间;果胶酶酶解提取酥李果汁的最佳工艺条件为:加酶量0.45 g/L、酶解温度38 ℃、酶解pH3.8、酶解时间72 min,出汁率提高27.13%;维素酶酶解提取酥李果汁的最佳工艺条件为:加酶量0.55 g/L、酶解温度41 ℃、酶解pH4.2、酶解时间105 min,出汁率提高20.18%;复合酶酶解提取酥李果汁的最佳工艺条件为:果胶酶添加量0.45 g/L、纤维素酶添加量0.55 g/L、酶解温度41 ℃、酶解pH4.0、酶解时间87 min,出汁率提高31.79%。三种加酶方式中,回归模型均能较好地反应相应酶制备酥李果浆的出汁率,所得工艺合理可靠。结论:在酶法提取酥李果汁过程中,果胶酶和纤维素酶的不同添加方式均能有效提高酥李出汁率,其中采用复合酶提取酥李果汁效果最佳。本研究成果为贵州李产品开发提供了一定的技术参考。     

杏鲍菇原生质体制备技术的研究

本文详细地探讨了杏鲍菇原生质体制备条件。结果表明:用0.6mol/L的甘露醇配制成质量比为2.5%,pH值为4.5～5的溶壁酶酶液,在酶液量与菌丝体的比值为20:1(V/W),温度30℃,转速为50r/min条件下酶解3h,可得到最高的原生质体得率。其原生质体数可达15.35×107个/ml。本研究为今后进行杏鲍菇原生质体的诱变及融合育种奠定基础。     

杏鲍菇原生质体制备、再生及其遗传转化体系的建立

为优化杏鲍菇GIM5.344 原生质体的制备、再生条件及建立稳定有效的遗传转化体系,对裂解酶、酶解温度、酶解时间、再生培养基稳渗剂等原生质体制备、再生条件以及潮霉素浓度、聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）介导转化方法进行优化,探究不同原生质体制备、再生条件对原生质体产量和再生率的影响。结果表明：选用溶壁酶1 进行酶解效果最佳,当酶解温度30 ℃、酶解时间2 h、再生培养基稳渗剂为甘露醇时,原生质体的产量可达到7×108 CFU/mL,再生率达到0.40%。得到转化子最多的转化方法为固体预培养+双层培养法,即PEG 介导转化后在无抗性再生培养基上28 ℃预培养48 h,然后再添加一层含有30 μg/mL 潮霉素的培养基进行拟转化子的筛选。所得转化子中的绿色荧光蛋白基因能稳定有效表达。     

超声波-复合酶法制备玉米秸秆低聚木糖工艺优化

以玉米秸秆为原料,利用超声波-复合酶法制备低聚木糖,研究超声波温度、超声处理时间、复合酶比例、复合酶添加量、酶解时间对低聚木糖制备的影响。在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken试验设计方案对制备条件进行优化,得出制备玉米秸秆低聚木糖的最佳工艺参数为:超声温度56℃,超声处理时间40min,添加0.8%(以玉米秸秆计)复合酶(木聚糖酶和纤维素酶按照2∶1的比例组成)并酶解30 min,在此条件下,酶解液中(以玉米秸秆计)还原糖含量为36.43mg/g、可溶性总糖含量为74.32mg/g、平均聚合度为2.04。高效液相色谱法成分分析得出低聚木糖糖液的主要成分是木二糖和木三糖。     

干酪乳杆菌LC2W原生质体的制备与再生

以干酪乳杆菌LC2W为出发菌株,对其进行原生质体制备与再生。通过单因素试验研究菌龄、溶菌酶质量浓度、酶解时间及酶解温度对干酪乳杆菌LC2W原生质体制备的影响,并对制备条件进行正交设计优化。结果表明：干酪乳杆菌LC2W原生质体制备的最佳条件为：菌龄8h、酶质量浓度10mg/mL、酶解时间75min、酶解温度42℃,在此条件下制备原生质体并进行再生实验,原生质体形成率达到97.15%,再生率可达到31.25%。研究结果可为L. casei LC2W食品级外源表达系统的构建提供初步的基础。     

产辅酶Q10的米曲霉原生质体制备条件研究

为了提高辅酶Q10的产生菌米曲霉菌的基因组改组育种效率,以提高辅酶Q10的产量,本试验对米曲霉原生质体的制备条件进行了研究。通过对影响制备效果的条件,即米曲霉的菌丝菌龄、酶解温度、时间和原生质体稳定剂的浓度四个因素进行全面优化,并利用正交试验确定了原生质体制备的适宜条件:菌龄为12h、原生质体渗透压稳定剂NaCl浓度为0.85mol/L、酶解时间为3.5min、酶解温度为30℃时,米曲霉原生质体制备效果最好,所得原生质体为6.3×106个/mL,再生率达到38.06%。较高的原生质体生成量和再生率为该菌后序的基因组改组研究奠定了基础。     

响应面法优化复合酶法提取紫菜藻红蛋白工艺

研究复合酶法提取紫菜藻红蛋白的最优工艺,筛选了复合酶的配比,并选取酶解温度、提取时间、加酶量和pH值为自变量,采用响应面法研究各因素及其交互作用对紫菜藻红蛋白得率和纯度的影响。结果表明,紫菜藻红蛋白复合酶法提取的最优酶配比为纤维素酶和果胶酶质量比7∶3,通过响应面优化,确定藻红蛋白最优提取工艺为：pH 6.8、酶解温度39 ℃、提取时间7.2 h、在5 g样品中加酶0.04 g。在此条件下藻红蛋白得率为2.257%,纯度达到1.656。经过验证,所得工艺参数准确,可用于复合酶法生产紫菜藻红蛋白。     

产琥珀酸放线杆菌原生质体制备与再生研究

研究了甘氨酸预处理、菌龄、酶浓度、酶解温度及酶解时间对产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)ATCC 55618原生质体制备和再生的影响。确定出最佳条件为:在添加1.0%甘氨酸的培养基中培养菌体6 h,用浓度为0.08 mg/mL的溶菌酶于37℃酶解40 min。得到的原生质体形成率为96.28%,再生率为42.11%。目前,还没有关于产琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)ATCC 55618原生质体制备的相关研究,研究结果为后续的原生质体诱变及基因组改组技术奠定了基础。     

产紫杉醇内生真菌Fusarium maire的原生质体制备和再生

通过正交设计等实验方法,详细的研究了培养基成分、酶系组成、菌龄、渗透压缓冲剂、pH、酶解温度、时间和再生培养方式等多种因素对Fusarium maire原生质体制备和再生的影响。实验结果表明:将Fusarium maire通过先静止2 d再以180 r/min震摇2 d后,以0.6 mol/L的KCl配制的pH为5的复合酶(3 mg/dL溶壁酶、2.5 mg/dL蜗牛酶1、mg/dL溶菌酶和0.5 mg/dL纤维素酶)中,32℃恒温酶解4 h,原生质体制备产量达3.2×107个/mL;纯化后的原生质体在25℃,以0.6 mol/L的蔗糖配制的YCM再生培养基上单层培养,其再生率达8.9%。为今后的通过原生质体融合和诱变研究,构建紫杉醇工程菌奠定了基础。