基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程

为进一步推广普及烟草代谢组学研究技术,规范烟草代谢组学数据的采集流程,提高烟草代谢组学数据的可比性和可用性,建立了适用于新鲜烟叶代谢组学研究的样品采集和质谱检测方法。将采集后的鲜烟叶迅速用锡箔纸包裹并在液氮中冷冻;将充分冷冻的烟叶样品在干冰包埋下转移至实验室,真空冷冻干燥;将干燥后的烟叶样品打碎成粉末,提取代谢物;采用9种主要基于GC-MS和LC-MS技术的检测方法收集代谢组数据,分别是6种靶向检测(植物色素、游离氨基酸、有机酸、生物碱及多酚和萜类化合物)和3种非靶向检测(脂类、基于GC-MS的全成分分析和基于LC-MS全成分分析)方法。采用所建方法对不同产区、不同品种及不同生长发育时期的第十叶位鲜烟叶进行分析。结果表明:①共定性定量500余种代谢物,涉及烟草主要初生、次生代谢物,其中绝对定量101种;②主成分分析表明不同生长发育期鲜烟叶的代谢组差异较大,如大多数胺类(包括游离氨基酸)代谢物随生长发育期变化其质量分数逐渐降低;同一期鲜烟叶代谢组的生态差异大于品种差异。该方法具有稳定性和可重复性高、数据量大且可靠、覆盖代谢物多等特点,可用于烟草代谢组学研究。     

提高上部烟叶工业可用性技术研究

为解决优质烟叶原料供应不足的问题,开展了提高上部烟叶可用性技术研究。采取上部6片烟叶成熟后一次采收调制技术,以成熟度为中心提高上部烟叶可用性,分析了上部烟叶成熟度提高后可用性的变化,比较了降焦处理对上部烟叶和中部烟叶可用性的影响。结果显示:上部6片烟叶一次成熟采收技术,可明显提高烟叶成熟度和叶片结构疏松程度,降低烤后烟叶的淀粉含量,改善上部烟叶香气质及口感,提高香气量及烟气浓度,减轻刺激性和杂气;示范结果可获得60%左右的成熟度好、结构疏松的上部烟叶,且烟叶的糖、氮、碱和淀粉含量适宜,主要化学成分协调;香气质中等~较好,香气量较足,可用于一、二类卷烟配方;上部烟叶经过降焦处理,香气质、烟气口感有所改善,杂气、刺激性的影响有所减弱,香气量得到较充分体现。     

我国烟区病毒病种类的血清学鉴定

为了全面掌握我国烟草病毒病的发生现状,于2010和2011年连续两年对全国13个主要烟区共409份病毒病样品进行了烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV) ELISA检测.结果表明,TMV侵染率最高,2010年样品侵染率高达64.6％,2011年为48.2％;2010年CMV侵染率为32.1％,2011年为28.2％;PVY侵染率2010年为15.6％,2011年为11.4％;TEV的侵染率最低.共存在7种复合侵染类型,TMV和CMV复合侵染最普遍,2010和2011年样品复合侵染率分别为34.9％和28.6％.说明TMV和CMV是侵染我国烟草的主要病毒,病毒病田间复合侵染较为严重.     

烟草普通花叶病毒抗血清的吸附纯化及应用

为了检测烟草普通花叶病毒(TMV),使用提纯病毒免疫小白鼠,制备TMV抗血清,对抗血清进行了吸附纯化,并建立了基于自制TMV抗血清的ELISA检测体系.蛋白电泳研究结果表明,提取的TMV纯度和浓度都很高;经过烟草总蛋白吸附纯化后,有效去除了非特异性反应;通过效价测定,确定TMV抗血清的效价高达1:40960;正交连续稀释法确定的ELISA检测最佳试剂浓度为:酶标二抗稀释度1:20000,TMV抗血清稀释度1:2000,病叶样品的稀释度为1:20.     

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

气相色谱-串联质谱检测新鲜烟叶中的萜类成分

为研究烟叶中的萜类成分含量(质量分数),采用选择反应监测模式,建立了同时测定新鲜烟叶中反,反-金合欢醇、α-植醇、顺冷杉醇、β-植醇、(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(α-CBD)、(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(β-CBD)、香紫苏醇、赖百当-13-烯-8,15-二醇、角鲨烯、2,3-环氧化鲨烯、双氢速甾醇、胆固醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、β-香树脂醇、α-香树脂醇、鹅去氧胆酸等21种萜类成分的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)方法;并采用该方法对云南、河南、贵州等3个产区的成熟期新鲜烟叶样品进行了分析。结果表明:在线性范围内21种萜类成分的R2为0.999 0～0.999 8;方法检测限为12.7～308.7 ng·g~(-1),定量限为35.8～984.6 ng·g~(-1);日内、日间精密度(RSD)分别为0.19%～8.28%、1.02%～9.35%。不同产区烟叶中主要萜类成分α-CBD的含量高低顺序为云南(98.83μg·g~(-1))河南(57.04μg·g~(-1))贵州(38.61μg·g~(-1)),且3个产区之间存在显著性差异。贵州产区烟叶中萜类成分含量的分布较云南和河南产区烟叶差异更大,遵义种植的南江3号品种烟叶中萜类含量与其他3个品种差异明显。该方法前处理简单,分析的萜类物质覆盖面广,可用于批量烟叶样品的检测。     

烟草根细胞原生质体的制备

根细胞是植物单细胞多组学研究的重要材料，烟草作为重要的模式生物之一，其根细胞原生质体的高效分离也越来越重要。为了获得产量和活性较高的烟草根细胞原生质体，以本氏烟草和栽培烟草K326为材料，采用酶解法制备了烟草根细胞原生质体，同时优化了影响原生质体分离纯化的酶解液组合、酶解时间和酶解渗透压等条件，并通过显微镜观察和台盼蓝染色鉴定其活性。结果表明:①以1.5%纤维素酶+1.5%果胶酶+0.4 mol/L甘露醇的酶解液组合，经过2h酶解、500 r/min离心10 min得到的根尖细胞原生质体产量和活性相对较高；②最终获得了活性大于70%、数量达到105数量级的较高质量烟草根原生质体。      

类受体蛋白激酶NtFERL对烟草质体色素含量的影响

为明确烟草NtFERL(FER-like gene)的生物学功能,同源克隆NtFERL基因并进行序列分析,同时采用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silence, VIGS)方法在本氏烟草中对该基因进行功能分析。结果表明:NtFERL基因位于烟草第7号染色体上,无内含子,编码序列长2 670 bp,编码889个氨基酸。NtFERL与拟南芥FERONIA基因同源性较高,在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分别为68.8%和71.1%。沉默NtFERL后,烟草叶色泛黄。质体色素含量分析显示,除新黄质外,叶绿素a、叶绿素b、β-胡萝卜素、叶黄素均显著降低,表明NtFERL可能对烟草色素含量起着正调控的作用。     

烟草根际土壤浸出液刺激烟草疫霉产孢和接种研究

通过烟草疫霉游动孢子接种处理,研究了烟草黑胫病菌的产孢条件和人工接种方法。结果表明:根际草炭土和田间肥沃土浸出液均能刺激黑茎病菌产生孢子囊和游动孢子,施加40μL烟草根际草碳土浸出液和60μL田间肥沃土浸出液,两种处理的孢子囊最高产量分别为1.43×104个/mL和1.06×104个/mL;2种土壤浸出液均在40μL处理时游动孢子的产量最高,分别为3.12×106个/mL和2.30×106个/mL。烟草黑胫病菌接种方法的比较结果表明,茎基部注射接种致病效果要明显优于灌根接种。     

雪茄烟叶（BESNO H382）不同组织器官及盐胁迫条件下内参基因的筛选

为了筛选适用于雪茄烟叶（BESNO H382）基因定量研究的内参基因,以温室栽培条件下雪茄烟叶的不同组织器官（旺长期根、茎、叶,盛花期花萼、花冠、柱头、子房、雄蕊、雌蕊及种子）及不同盐处理条件下（300 mmol/L NaCl处理不同时间）的样品为材料,采用实时荧光定量PCR技术对从雪茄烟叶转录组数据中筛选到的10个候选内参基因进行分析,同时使用geNorm、NormFinder和BestKeeper等3种软件综合评价这些候选基因的表达稳定性。结果表明,RPL14A和UBC27最适合作为雪茄烟叶不同组织的内参基因;UBC28最适合作为雪茄烟叶不同盐处理条件下的内参基因。分别以UBC27、UBC28和RPL14A为内参基因考察了胁迫相关基因脯氨酸合成酶基因（P5CS）在盐胁迫下的表达情况,发现P5CS上调表达且相对3个内参基因的表达量和变化趋势均较为一致。