玉溪、许昌烤烟烟叶中淀粉酶基因的表达及酶活性分析

为分析河南、云南两地烤后烟叶中糖含量差异形成的原因,以许昌、玉溪成熟期烤烟中部烟叶为材料,通过基因芯片数据寻找与淀粉降解相关的差异基因。利用实时定量PCR和淀粉酶活性分析进行验证,并测定淀粉、总糖的含量(质量分数)。结果表明:获得4个与淀粉降解相关的差异基因,其中2个为α-淀粉酶基因、2个为β-淀粉酶基因,这4个基因在玉溪烟叶中的表达量明显高于许昌烟叶。玉溪烟叶中的α-和β-淀粉酶活性高于许昌烟叶。在玉溪、许昌成熟期中部烟叶中,淀粉含量分别为33.00%和35.00%,两者差异不大。烤前烟叶的总糖含量玉溪烟叶(2.10%)低于许昌烟叶(3.20%),而烤后烟叶的总糖含量玉溪烟叶(36.46%)高于许昌烟叶(20.60%)。表明影响烤后烟叶总糖含量的主要因素为淀粉酶,而不是烤前烟叶的淀粉积累量。     

植物研究中的流式细胞术及其在烟草中的应用进展

流式细胞术作为一种快速、灵敏的细胞分析分选技术,目前已广泛应用于植物学研究的多个领域。为了拓展流式细胞术在烟草研究中的应用范围,介绍了流式细胞仪的工作原理,并阐述了流式细胞术在植物细胞核DNA含量和倍性分析、植物核型分析及分选、细胞分选与其他技术的联合等学科领域的应用概况。在总结流式细胞术在烟草相关研究领域应用现状的基础上,展望了流式细胞术在烟草单细胞组学、病害防治和烟气毒理学检测等方面进一步研究与应用的可能性。     

高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定烟叶中10种多酚类化合物

为研究烟叶中的植物多酚类化合物,利用高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-TQMS)技术,建立了同时分析烟叶中山奈酚(Kaempferol)、花青素(Cyanidin)、氯化飞燕草色素(Delphinidin chloride)、鼠李金(Rhamnazin)、绿原酸(Chlorogenic acid)、氯化飞燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷(Delphinidin 3-O-β-glucopyranoside chloride)、原花青素B2(Procyanidine B2)、氯化花青素鼠李葡糖苷(Keracyanin chloride)、芸香苷(Rutin)和莨菪亭(Scopoletin)等10种植物多酚类化合物质量分数的方法。采用实时离子多反应检测模式,获得10种植物多酚类化合物的特征碎片离子峰,并对烟草花叶病毒(TMV)感染的烟叶样品进行了测定。结果表明:①10种植物多酚类化合物在线性范围内的相关系数(r)为0.999 0～0.999 6,方法的检出限为1～200μg/L,日内精密度(RSD)为0.64%～8.72%,日间精密度(RSD)为1.05%～7.93%;回收率为79.66%～112.74%;②TMV感染极显著(p0.01)增加了烟叶中山奈酚、花青素、氯化飞燕草色素、氯化飞燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷和芸香苷的质量分数,显著(p0.05)降低了烟叶中鼠李金的质量分数,增加了绿原酸的质量分数;③TMV病毒感染对原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷和莨菪亭的影响不大,差异不显著。该方法具有良好的灵敏度、精密度和回收率,可用于同时分析植物多酚类化合物。     

烟草慢阴离子通道蛋白基因NtSLAH1的克隆及表达分析

为了揭示烟草慢阴离子通道蛋白(Slowly activating Anion Channel,SLAC)家族成员在氯离子转运过程中的作用,通过同源克隆的方法从栽培烟草K326中克隆到1个SLAC同源基因(SLAC Homologue),命名为NtSLAH1,其开放阅读框长度为1107 bp,编码368个氨基酸,表达蛋白定位在细胞质膜上。与已报道的其他植物SLAH相比,NtSLAH1与拟南芥SLAH1和SLAH4序列相似性更高、进化距离更近。实时定量荧光PCR(qRT-PCR)结果显示,NtSLAH1在根中的表达量最高,高浓度NaCl处理下其表达量下降,表明NtSLAH1可能在烟草盐胁迫响应及氯离子吸收过程中发挥重要作用。     

普通烟草NtNDPK4基因的克隆与表达分析

为揭示核苷二磷酸激酶在烟草中的功能和作用机制,从烟草K326克隆获得了1个核苷二磷酸激酶基因并命名为NtNDPK4,CDS长度为678 bp,编码225个氨基酸。生物信息学分析表明,NtNDPK4蛋白分子量大小24.95 kDa,pI约8.34,亚细胞定位预测在叶绿体上,进化分析显示该蛋白属于NDPKⅡ型,顺式作用元件分析预测该基因启动子含有激素和光照响应的作用元件。组织表达特异性分析结果显示,NtNDPK4在烟草各组织中均有表达。在MeJA、ABA、GR-24、IAA、GA和6-BA等激素处理下,NtNDPK4基因的表达显著上调,尤其是GA处理后NtNDPK4基因表达上调了近50倍。黑暗生长的烟草幼苗恢复光照24 h后,NtNDPK4基因表达明显上调。这表明烟草NtNDPK4基因可能参与激素和光照响应。     

UPLC-MS/MS法测定新鲜烟草中的脱落酸和茉莉酸

为更加快速准确地测定烟草中的酸性植物激素,通过优化样品的前处理条件,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定烟草中脱落酸和茉莉酸的方法。结果表明:1脱落酸和茉莉酸的检出限分别为0.082和0.027 ng/m L,加标回收率均在96.4%~110.8%之间,脱落酸的日内和日间相对标准偏差(RSDs)均低于3.86%,茉莉酸的日内和日间RSDs均低于4.53%。2该方法样品用量仅为25 mg;所采用的负离子检测模式选择性高、干扰小。适用于烟草样品中酸性植物激素内源性水平的准确检测。     

基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程

为进一步推广普及烟草代谢组学研究技术,规范烟草代谢组学数据的采集流程,提高烟草代谢组学数据的可比性和可用性,建立了适用于新鲜烟叶代谢组学研究的样品采集和质谱检测方法。将采集后的鲜烟叶迅速用锡箔纸包裹并在液氮中冷冻;将充分冷冻的烟叶样品在干冰包埋下转移至实验室,真空冷冻干燥;将干燥后的烟叶样品打碎成粉末,提取代谢物;采用9种主要基于GC-MS和LC-MS技术的检测方法收集代谢组数据,分别是6种靶向检测(植物色素、游离氨基酸、有机酸、生物碱及多酚和萜类化合物)和3种非靶向检测(脂类、基于GC-MS的全成分分析和基于LC-MS全成分分析)方法。采用所建方法对不同产区、不同品种及不同生长发育时期的第十叶位鲜烟叶进行分析。结果表明:①共定性定量500余种代谢物,涉及烟草主要初生、次生代谢物,其中绝对定量101种;②主成分分析表明不同生长发育期鲜烟叶的代谢组差异较大,如大多数胺类(包括游离氨基酸)代谢物随生长发育期变化其质量分数逐渐降低;同一期鲜烟叶代谢组的生态差异大于品种差异。该方法具有稳定性和可重复性高、数据量大且可靠、覆盖代谢物多等特点,可用于烟草代谢组学研究。     

烤烟上部叶成熟过程中代谢组的差异分析

为明确烤烟上部叶成熟过程中物质转化规律及代谢组的差异,利用GC-MS非靶向代谢组学方法并结合激素及色素等的测定对烟株打顶后20、30、40、50和60 d的上部叶代谢物进行分析。结果表明:上部烟叶成熟过程可分为3个阶段,分别为烟株打顶后20~30 d、40~50 d和60 d。随烟叶成熟进程的推进,叶绿素和类胡萝卜素含量（质量分数）逐渐下降,在打顶后40 d时下降最为明显,游离氨基酸和总氮含量整体呈下降趋势,总植物碱和碳水化合物含量整体呈升高趋势,烟叶中促进生长类激素含量在打顶后40 d显著下降,促进成熟衰老类激素含量在打顶后40 d显著提高,打顶后40 d可能是上部烟叶成熟过程中生理功能由盛转衰的关键节点。通过正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）筛选出38种差异代谢物,主要是氨基酸类、糖类和脂肪酸类代谢物,其中4-氨基丁酸、果糖、阿洛糖、棕榈酸、亚麻酸、甘油酸、苹果酸、莨菪亭、奎尼酸等可能是上部烟叶成熟过程中较关键的代谢物。差异代谢物显著（p＜0.05）富集在糖代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢等通路中,其中乙醛酸和二羧酸代谢,不饱和脂肪酸的生物合成,TCA循环,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等通路在烟叶成熟过程中起重要的调控作用。      

八大香型风格新鲜烟叶代谢特征的生态成因分析

为考察生态因素对鲜烟叶代谢特征的影响,根据全国烤烟烟叶香型风格区划研究结果,按照八大香型风格,结合气象数据,分析了鲜烟叶特征代谢物(脂类化合物、含氮化合物、糖类化合物、有机酸类化合物、核酸类化合物、甾醇类化合物)与不同气象因子的相关性,并分析了各类代谢物的生态成因。结果表明,每个风格区的特征代谢物均与生态条件一定程度相关,温度、日照时数、降雨量等生态特征数据的变化可解释部分特征代谢产物的积累,表明鲜烟叶的代谢特征与环境生态条件紧密相关,其中与代谢物含量有较高相关性的气候因子为大田中后期温度和大田中后期日照时数。      

气相色谱-串联质谱检测新鲜烟叶中的萜类成分

为研究烟叶中的萜类成分含量(质量分数),采用选择反应监测模式,建立了同时测定新鲜烟叶中反,反-金合欢醇、α-植醇、顺冷杉醇、β-植醇、(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(α-CBD)、(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(β-CBD)、香紫苏醇、赖百当-13-烯-8,15-二醇、角鲨烯、2,3-环氧化鲨烯、双氢速甾醇、胆固醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、β-香树脂醇、α-香树脂醇、鹅去氧胆酸等21种萜类成分的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)方法;并采用该方法对云南、河南、贵州等3个产区的成熟期新鲜烟叶样品进行了分析。结果表明:在线性范围内21种萜类成分的R2为0.999 0～0.999 8;方法检测限为12.7～308.7 ng·g~(-1),定量限为35.8～984.6 ng·g~(-1);日内、日间精密度(RSD)分别为0.19%～8.28%、1.02%～9.35%。不同产区烟叶中主要萜类成分α-CBD的含量高低顺序为云南(98.83μg·g~(-1))河南(57.04μg·g~(-1))贵州(38.61μg·g~(-1)),且3个产区之间存在显著性差异。贵州产区烟叶中萜类成分含量的分布较云南和河南产区烟叶差异更大,遵义种植的南江3号品种烟叶中萜类含量与其他3个品种差异明显。该方法前处理简单,分析的萜类物质覆盖面广,可用于批量烟叶样品的检测。