烟草抗冷相关基因在两种不同育苗方式下的低温应答差异分析

为探究水旱两段式育苗技术抗低温胁迫的分子机制,利用生物信息学方法分析了烟草低温应答关键转录因子CBF（C-repeat binding factor）基因家族的进化关系、基因结构、保守结构域及其启动子顺式作用元件,进一步利用qRT-PCR分析两种育苗方式下（常规漂浮育苗和水旱两段式育苗）NtCBF基因家族、CBF-regulon基因和非CBF-regulon相关基因的低温应答模式。结果表明,NtCBF15~NtCBF21基因与拟南芥CBF5、CBF6基因进化关系相近,NtCBF1~NtCBF14基因与拟南芥CBF1~CBF4基因进化关系相近。NtCBF基因家族成员均具有motif 1/2/4/5保守蛋白结构域,表明该家族在进化过程中较为保守;其中,NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF10、NtCBF13、NtCBF14和NtCBF18等8个基因启动子区具有低温响应元件。低温处理后,NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及CBF-regulon基因中NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3的表达量均显著升高。推测NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及其下游调控基因NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3在水旱两段式育苗抗低温胁迫过程中起重要作用。      

玉溪、许昌烤烟烟叶中淀粉酶基因的表达及酶活性分析

为分析河南、云南两地烤后烟叶中糖含量差异形成的原因,以许昌、玉溪成熟期烤烟中部烟叶为材料,通过基因芯片数据寻找与淀粉降解相关的差异基因。利用实时定量PCR和淀粉酶活性分析进行验证,并测定淀粉、总糖的含量(质量分数)。结果表明:获得4个与淀粉降解相关的差异基因,其中2个为α-淀粉酶基因、2个为β-淀粉酶基因,这4个基因在玉溪烟叶中的表达量明显高于许昌烟叶。玉溪烟叶中的α-和β-淀粉酶活性高于许昌烟叶。在玉溪、许昌成熟期中部烟叶中,淀粉含量分别为33.00%和35.00%,两者差异不大。烤前烟叶的总糖含量玉溪烟叶(2.10%)低于许昌烟叶(3.20%),而烤后烟叶的总糖含量玉溪烟叶(36.46%)高于许昌烟叶(20.60%)。表明影响烤后烟叶总糖含量的主要因素为淀粉酶,而不是烤前烟叶的淀粉积累量。     

不同培养条件下纳米碳溶胶对烟草细胞生长的影响

为进一步明确纳米碳溶胶的促生效果及其生理机制,在固体和液体两种培养条件下,以烟草BY-2细胞为试验材料,对纳米碳溶胶处理后细胞生物量、营养元素积累量、水通道蛋白基因和细胞周期蛋白基因的表达量以及悬浮细胞生长特性等指标进行了测定。结果表明,固体培养基中添加纳米碳溶胶能有效促进烟草愈伤组织生长,增加N、P、K养分积累量;其中50mg/L浓度的纳米碳溶胶处理,愈伤组织N、P、K养分积累量增加幅度最大,分别为41.3%、27.6%和47.0%。同时,纳米碳溶胶能显著提高培养前期水通道蛋白基因NtPIP1和细胞周期蛋白基因CycB的表达量,这是其促进愈伤组织生长的基础。在悬浮培养体系中,纳米碳溶胶处理对培养前期和中期悬浮细胞密度、密实体积以及死亡率无显著影响,表现出良好的生物相容性;在培养后期,10mg/L浓度的纳米碳溶胶处理对细胞生长产生一定抑制作用,表现为细胞密度下降和细胞活力降低。可见,纳米碳溶胶对烟草细胞生长的作用效果受培养条件和纳米碳溶胶浓度的共同影响。     

植物研究中的流式细胞术及其在烟草中的应用进展

流式细胞术作为一种快速、灵敏的细胞分析分选技术,目前已广泛应用于植物学研究的多个领域。为了拓展流式细胞术在烟草研究中的应用范围,介绍了流式细胞仪的工作原理,并阐述了流式细胞术在植物细胞核DNA含量和倍性分析、植物核型分析及分选、细胞分选与其他技术的联合等学科领域的应用概况。在总结流式细胞术在烟草相关研究领域应用现状的基础上,展望了流式细胞术在烟草单细胞组学、病害防治和烟气毒理学检测等方面进一步研究与应用的可能性。     

不同醇化卷烟原料表面微生物的群落结构及对大分子物质的降解功能

为探究醇化卷烟原料表面微生物的群落结构及对大分子物质的降解功能,采用宏基因组测序技术分析醇化2年的烤烟烟梗、香料烟和烤烟片烟样品的表面微生物群落结构,并对3种醇化卷烟原料中的果胶、纤维素、淀粉、蛋白质和木质素含量与表面微生物群落组成进行相关分析。结果表明,3种醇化卷烟原料中,醇化烤烟烟梗淀粉和蛋白质含量最低,醇化烤烟片烟果胶、纤维素和木质素含量最低。醇化烤烟烟梗的优势菌属为泛菌属（Pantoea）、不动杆菌属（Acinetobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和假单胞菌属（Pseudomonas）,醇化香料烟的优势菌属为泛菌属（Pantoea）、假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter）,醇化烤烟片烟的优势菌属为泛菌属（Pantoea）、芽孢杆菌属（Bacillus）和土地芽孢杆菌属（Terribacillus）。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）含有较多与淀粉降解相关的基因,其相对丰度与醇化样品淀粉含量显著负相关;鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和克雷伯氏菌属（Kl...     

高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定烟叶中10种多酚类化合物

为研究烟叶中的植物多酚类化合物,利用高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-TQMS)技术,建立了同时分析烟叶中山奈酚(Kaempferol)、花青素(Cyanidin)、氯化飞燕草色素(Delphinidin chloride)、鼠李金(Rhamnazin)、绿原酸(Chlorogenic acid)、氯化飞燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷(Delphinidin 3-O-β-glucopyranoside chloride)、原花青素B2(Procyanidine B2)、氯化花青素鼠李葡糖苷(Keracyanin chloride)、芸香苷(Rutin)和莨菪亭(Scopoletin)等10种植物多酚类化合物质量分数的方法。采用实时离子多反应检测模式,获得10种植物多酚类化合物的特征碎片离子峰,并对烟草花叶病毒(TMV)感染的烟叶样品进行了测定。结果表明:①10种植物多酚类化合物在线性范围内的相关系数(r)为0.999 0～0.999 6,方法的检出限为1～200μg/L,日内精密度(RSD)为0.64%～8.72%,日间精密度(RSD)为1.05%～7.93%;回收率为79.66%～112.74%;②TMV感染极显著(p0.01)增加了烟叶中山奈酚、花青素、氯化飞燕草色素、氯化飞燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷和芸香苷的质量分数,显著(p0.05)降低了烟叶中鼠李金的质量分数,增加了绿原酸的质量分数;③TMV病毒感染对原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷和莨菪亭的影响不大,差异不显著。该方法具有良好的灵敏度、精密度和回收率,可用于同时分析植物多酚类化合物。     

烟草慢阴离子通道蛋白基因NtSLAH1的克隆及表达分析

为了揭示烟草慢阴离子通道蛋白(Slowly activating Anion Channel,SLAC)家族成员在氯离子转运过程中的作用,通过同源克隆的方法从栽培烟草K326中克隆到1个SLAC同源基因(SLAC Homologue),命名为NtSLAH1,其开放阅读框长度为1107 bp,编码368个氨基酸,表达蛋白定位在细胞质膜上。与已报道的其他植物SLAH相比,NtSLAH1与拟南芥SLAH1和SLAH4序列相似性更高、进化距离更近。实时定量荧光PCR(qRT-PCR)结果显示,NtSLAH1在根中的表达量最高,高浓度NaCl处理下其表达量下降,表明NtSLAH1可能在烟草盐胁迫响应及氯离子吸收过程中发挥重要作用。     

UPLC-MS/MS法测定新鲜烟草中的脱落酸和茉莉酸

为更加快速准确地测定烟草中的酸性植物激素,通过优化样品的前处理条件,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定烟草中脱落酸和茉莉酸的方法。结果表明:1脱落酸和茉莉酸的检出限分别为0.082和0.027 ng/m L,加标回收率均在96.4%~110.8%之间,脱落酸的日内和日间相对标准偏差(RSDs)均低于3.86%,茉莉酸的日内和日间RSDs均低于4.53%。2该方法样品用量仅为25 mg;所采用的负离子检测模式选择性高、干扰小。适用于烟草样品中酸性植物激素内源性水平的准确检测。     

基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程

为进一步推广普及烟草代谢组学研究技术,规范烟草代谢组学数据的采集流程,提高烟草代谢组学数据的可比性和可用性,建立了适用于新鲜烟叶代谢组学研究的样品采集和质谱检测方法。将采集后的鲜烟叶迅速用锡箔纸包裹并在液氮中冷冻;将充分冷冻的烟叶样品在干冰包埋下转移至实验室,真空冷冻干燥;将干燥后的烟叶样品打碎成粉末,提取代谢物;采用9种主要基于GC-MS和LC-MS技术的检测方法收集代谢组数据,分别是6种靶向检测(植物色素、游离氨基酸、有机酸、生物碱及多酚和萜类化合物)和3种非靶向检测(脂类、基于GC-MS的全成分分析和基于LC-MS全成分分析)方法。采用所建方法对不同产区、不同品种及不同生长发育时期的第十叶位鲜烟叶进行分析。结果表明:①共定性定量500余种代谢物,涉及烟草主要初生、次生代谢物,其中绝对定量101种;②主成分分析表明不同生长发育期鲜烟叶的代谢组差异较大,如大多数胺类(包括游离氨基酸)代谢物随生长发育期变化其质量分数逐渐降低;同一期鲜烟叶代谢组的生态差异大于品种差异。该方法具有稳定性和可重复性高、数据量大且可靠、覆盖代谢物多等特点,可用于烟草代谢组学研究。     

气相色谱-串联质谱检测新鲜烟叶中的萜类成分

为研究烟叶中的萜类成分含量(质量分数),采用选择反应监测模式,建立了同时测定新鲜烟叶中反,反-金合欢醇、α-植醇、顺冷杉醇、β-植醇、(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(α-CBD)、(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(β-CBD)、香紫苏醇、赖百当-13-烯-8,15-二醇、角鲨烯、2,3-环氧化鲨烯、双氢速甾醇、胆固醇、菜籽甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、β-谷甾醇、β-香树脂醇、α-香树脂醇、鹅去氧胆酸等21种萜类成分的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)方法;并采用该方法对云南、河南、贵州等3个产区的成熟期新鲜烟叶样品进行了分析。结果表明:在线性范围内21种萜类成分的R2为0.999 0～0.999 8;方法检测限为12.7～308.7 ng·g~(-1),定量限为35.8～984.6 ng·g~(-1);日内、日间精密度(RSD)分别为0.19%～8.28%、1.02%～9.35%。不同产区烟叶中主要萜类成分α-CBD的含量高低顺序为云南(98.83μg·g~(-1))河南(57.04μg·g~(-1))贵州(38.61μg·g~(-1)),且3个产区之间存在显著性差异。贵州产区烟叶中萜类成分含量的分布较云南和河南产区烟叶差异更大,遵义种植的南江3号品种烟叶中萜类含量与其他3个品种差异明显。该方法前处理简单,分析的萜类物质覆盖面广,可用于批量烟叶样品的检测。