米曲霉AAP新基因的异源表达及其酶学性质研究

通过生物信息学分析发现了米曲霉(Aspergillus oryzae)中属于氨肽酶M18家族的新成员天冬酰胺氨肽酶(AAP)基因,经反转录克隆获得该基因,实现了其在毕赤酵母GS115中的表达,同时研究了重组AAP的酶学性质及其在大豆蛋白水解中的应用。结果表明,重组AAP的分子质量约54.0 kDa,在较广的pH范围内有活性(pH 6.0～9.5),最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,Zn~(2+)和Ca~(2+)对该酶起促进作用,EDTA能够显著抑制该酶的酶活。以Asp-pNA为底物时,K_m为0.42 mmol/L,V_(max)为21.57μmol/(mL·min),该酶具有水解N末端为天冬氨酸和谷氨酸的底物特异性。重组AAP可显著降低大豆多肽的苦味,提高水解度,具有在食品中的应用潜力。     

玛咖多糖的提取条件及体外活性研究

优化玛咖多糖的提取条件,并通过体外实验对其抗氧化活性和降血脂功效进行研究。采用超声波辅助热水浸提并结合响应面法对玛咖多糖提取条件进行优化,通过自由基清除率评价玛咖多糖的抗氧化活性,基于玛咖多糖与胆酸钠的结合能力评价其降血脂功效。在提取温度50℃,提取时间42 min,超声功率220 W,料液比(g/mL)1∶32的条件下,多糖提取率达到最高11.0%。将玛咖粗多糖通过离子交换柱分离得到3个多糖组分,分别为玛咖多糖1、玛咖多糖2和玛咖多糖3。其中玛咖粗多糖、玛咖多糖1和玛咖多糖2具有较强的抗氧化活性,对DPPH自由基的较佳清除率分别为83.9%、81.8%和63.7%,对羟基自由基的较佳清除率分别为73.3%、56.8%和76.7%。此外,玛咖多糖3在体外对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合率分别为49.1%和32.3%。研究表明,玛咖粗多糖、玛咖多糖1和玛咖多糖2具有较好的抗氧化活性,玛咖多糖3具有一定的降血脂功效。     

棉酚脱除菌株的筛选及棉粕混菌固态发酵研究

棉籽饼粕是一类重要的蛋白饲料资源,但棉粕中有毒物质游离棉酚的存在影响了其在畜牧业中的使用。通过醋酸棉酚与菌株共培养的方法,筛选获得了一株在液体培养条件下棉酚脱除率达90%以上的菌株ST-141,通过16S r DNA序列比对分析和Biolog微生物鉴定,确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。利用该菌株与酿酒酵母N5对棉粕进行混菌固态发酵,30℃发酵48h后棉粕中游离棉酚脱除率达48.5%,同时粗蛋白含量增加19%,氨基酸总量上升22.2%,必需氨基酸含量增加28.4%,表现出良好的棉籽饼粕固态发酵应用潜力。     

芍药花提取物对果蔬腐败菌的抑菌活性及其在樱桃番茄保鲜中的应用

以芍药(Paeonia lactiflora)花提取物为研究对象,通过抑菌圈、最低抑制浓度及最低致死浓度评价其对主要果蔬腐败菌的抑菌性能;通过提取物对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生长、电导率、内容物质、可溶性糖的影响探究芍药花提取物的抑菌方式;对腐败率、失重率、可溶性固形物及Vc含量的测定考察提取物对樱桃番茄的保鲜效果。结果表明:芍药花提取物对细菌、酵母均有很强的抑制作用,尤其对枯草芽孢杆菌最低抑制质量浓度和最低致死质量浓度分别低至2 mg/mL和4 mg/mL;提取物通过增加细胞膜的通透性及破坏细胞膜的结构发挥抑菌作用;与对照相比,芍药花提取物能够明显降低樱桃番茄腐败率和失重率,减少可溶性固形物及Vc的损失,是一种具有应用前景的优良保鲜剂。     

降解浓香型白酒中氨基甲酸乙酯菌株的筛选及产酶特性研究

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种可致癌物质,普遍存在于发酵食品中,研究如何降低发酵食品中EC的含量对提高发酵食品的安全性具有重要意义。该研究采用高通量筛选技术,从浓香型白酒酒醅中分离得到1株能够同时降低EC及其前体尿素的解淀粉芽孢杆菌JP21。将该菌株用于模拟白酒窖内发酵,发酵结束时酒醅中的尿素和EC分别减少了12%和17%,并且对酒醅中挥发性物质无显著影响。通过对该菌株所产EC和尿素降解酶进行初步纯化及酶学性质研究,发现该酶对尿素和EC均有降解作用。酶的最适反应p H值为5.5,最适反应温度为35℃,可耐受低浓度乙醇。研究采用发酵食品体系内源微生物干预的方法,实现了对混菌发酵体系中氨(胺)类危害物的有效减控。     

阴离子交换层析法纯化聚唾液酸工艺

以大肠杆菌发酵所产聚唾液酸粗品(含蛋白质、核酸、无机盐和色素等杂质)为纯化对象,通过静态吸附和梯度洗脱实验选择了分离效果较好的阴离子交换介质Q-琼脂糖凝胶FF,对聚唾液酸的纯化工艺条件进行优化. 得到最佳洗脱条件为：洗脱液为pH 7.2的NaCl-0.02 mol/L磷酸钠缓冲液体系,流速0.8 mL/min,洗脱线性梯度方程为CNaCl=0.0017VEluent (CNaCl为NaCl浓度,VEluent为洗脱液体积),层析柱体积46 mL时最大进样量4.0 mL. 该条件下聚唾液酸回收率在86.0%以上,纯化后样品中的蛋白质含量从1.9%降低至0.04%,纯度在98%以上. 紫外吸收光谱和高效凝胶过滤色谱分析表明,聚唾液酸产品组分均一,重均分子量为303 kDa.     

大肠杆菌中dAb一级结构与可溶性表达关联

抗体类药物研发是药物发展的一个重要研究方向,目前已有许多抗体在原核表达体系中成功表达。人们通常采用"试错法"优化表达系统,提高蛋白质产量,但该方法费时费力且成功率低,因此迫切需要探索氨基酸组成与蛋白质可溶性表达水平之间的关联,以指导表达系统的选择或蛋白质分子的定向改造。在单域抗体dAb分子的C端末尾添加一个氨基酸,发现单个氨基酸的改变足以引起蛋白质可溶性表达量发生显著变化。通过层次聚类、Cluster Omega对dAb氨基酸序列与表达水平分别进行分类,发现两者分类一致的比例达到70%,证明了氨基酸序列与蛋白质表达水平间的关联。通过对65个CDR随机突变的dAb分子进行线性建模分析其可溶性表达量,发现对dAb胞外质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为S(丝氨酸),R(精氨酸),N(天冬酰胺),D(天冬氨酸),Q(谷氨酰胺),Y(酪氨酸),F(苯丙氨酸),G(甘氨酸),对dAb胞内质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为G,R,C(半胱氨酸),N,S,Y,K(赖氨酸),A(丙氨酸),对dAb蛋白质总量有显著影响的组合为R,S,G,N,Y,C,Q,F,T(苏氨酸)。其中R、S和G的含量显著影响dAb的可溶性表达量且该影响不受分布位置的影响。蛋白质的极性亦是其可溶性表达水平的显著影响因素。     

生物酶法改性提高植物组织化蛋白的产品特性

以低温脱脂豆粕、大豆分离蛋白、谷朊粉和小麦淀粉为原料,研究生物酶[菠萝蛋白酶、转谷氨酰胺酶(TG)酶]法改性对植物组织化蛋白产品特性的影响,并探讨了酶改性对植物蛋白组织化过程中化学键和蛋白质二级结构的变化规律。研究表明:经菠萝蛋白酶酶解处理的植物组织化蛋白的产品特性优于TG酶,当菠萝蛋白酶加酶量为12.0 U/g时,组织化蛋白的弹性、咀嚼度分别提高了48%和71%;植物蛋白经菠萝蛋白酶酶解处理后,组织化蛋白中二硫键、氢键与疏水键三者交互作用增强,同时蛋白质二级结构中β-折叠向无规则卷曲转变,无规则卷曲含量提高43%,表明二硫键、氢键和疏水键三者交互作用和二级结构中的无规则卷曲有利于植物组织化蛋白弹性和咀嚼度的改善,其中无规则卷曲含量起关键性作用。     

糖醇对结冷胶凝胶质构的影响

利用物性分析仪研究赤藓糖醇、木糖醇、乳糖醇对结冷胶凝胶质构的影响。结果表明：3 种糖醇都能使结冷胶凝胶强度和硬度降低,且都随糖醇质量浓度的增加而降低,3 种糖醇的影响力为乳糖醇>木糖醇>赤藓糖醇,但对结冷胶凝胶脆性的影响不显著。其次,15 g/100 mL的复合糖醇对结冷胶凝胶质构的影响皆小于相同质量浓度的单一糖醇对质构的影响,复合糖醇间不存在正协同作用。最后,在以K+为成胶离子时（40～400 mmol/L）,乳糖醇对结冷胶凝胶质构有影响;在以Ca2+为成胶离子时,只在低浓度时（2～10 mmol/L）,乳糖醇对结冷胶凝胶质构影响明显,当Ca2+浓度升高时（10～50 mmol/L）,乳糖醇对结冷胶凝胶质构几乎不产生影响。     

植烷醇磷酸甘露糖的酶法合成及应用

内质网(ER)腔内的甘露糖基化修饰共同存在于N-糖基化、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定化、O-和C-甘露糖基化中,对于真核生物来说具有重要的作用。ER腔内的甘露糖基化的底物供体为多萜醇磷酸甘露糖(Dol-P-Man),因此Dol-P-Man的合成对于理解不同种类的糖基化修饰具有重要的意义。本研究原核表达纯化了酵母Dol-P-Man的合成酶(Dpm1),并鉴定了重要的DXD motif。利用纯化的Dpm1蛋白,及简单的植烷醇(Phytanol)代替复杂的多萜醇(Dolichol),体外酶法合成了Dol-P-Man的替代结构Phy-P-Man。在N-糖基化途径中Alg3催化Dol-PPGlcNAc2-Man5和Dol-P-Man生成Dol-PP-GlcNAc2-Man6。通过体外酶反应,本研究证明PhyP-Man同样能够作为Alg3的底物供体用于N-糖基化途径的研究,为以后合成高甘露糖型的N糖结构及GPI、O-和C-甘露糖基化的研究奠定了基础。