以猪小肠黏膜提取物作为α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶IV的酶活力分析体系的建立

α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase 4,DPP-4）是II型糖尿病治疗中2 种重要的靶向酶。这两种商品化酶价格昂贵且主要来源于微生物,难以有效用于两种酶抑制剂的筛选,而这两种酶均普遍存在哺乳动物的小肠中。为了获得经济有效、来源于哺乳动物体内的α-葡萄糖苷酶和DPP-4,本研究收集新鲜的猪小肠黏膜分泌物及上皮细胞,对比分析了猪小肠不同部位黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶和DPP-4的活力。以猪小肠黏膜提取物作为α-葡萄糖苷酶和DPP-4的酶反应体系,并且利用这两种酶的阳性药（阿卡波糖和抑二肽素A（diprotin A,IPI））分别进行了抑制率验证和评价。阿卡波糖对商品和猪回肠源α-葡萄糖苷酶的半数有效抑制质量浓度（median inhibition concentration,IC50）分别是1.102 4、0.244 7 mg/mL;IPI对商品和猪回肠源DPP-4的IC50分别为19.119 7、41.268 4 μg/mL。通过比较发现,猪回肠黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶和DPP-4比活力分别为0.084 1、0.053 4 U/mg,在3 种黏膜提取物中均为最高,因此选择猪回肠黏膜提取物作为商品化α-葡萄糖苷酶和DPP-4的替代物进行抑制剂的筛选。     

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用益生菌的筛选及特性分析

以实验室77 株益生菌为研究对象,从其菌体细胞代谢物（cell-free excretory supernatants,CFS）和细胞内容物（cell-free extracts,CFE）两方面分析菌株对α-葡萄糖苷酶的抑制活性;同时还从耐酸性、细胞黏附性等方面对具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株进行了益生特性评价;最后利用主成分分析进行综合性评价,以期筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的益生菌。结果表明,77?株益生菌的CFE对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用;而CFS对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用,抑制率为2.53%～15.76%。选取抑制率明显高于其他益生菌（编号为ST-2、1.1881、GS-3和BLP12）菌株进行益生特性的研究。其中ST-2表现出很高的耐酸性和细胞黏附性;GS-3在模拟消化液中有很强的耐受性等,各菌株特性不一。主成分分析表明菌株BLP12的综合性能最好：其对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达15.10%;于pH?2.0孵育3?h后,存活率能达到71.04%;于2.0%的胆盐条件下孵育24?h,存活率为0.70%;依次经模拟唾液、胃液、肠液消化后,存活率仍能达到88.27%,但对HT-29细胞的黏附率较低,仅为1.93%,总体上菌株BLP12对体外模拟胃肠环境的适应性很强。该菌株经过16S基因序列鉴定为植物乳杆菌,可作为降糖益生菌株应用于降糖食品的开发。     

酵母源葡萄糖耐量因子GTF的纯化及其铬价态分析

酵母源葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor,GTF)可有效调节糖代谢、提高胰岛素与受体的亲和力、改善脂肪代谢。但GTF中的铬的价态不清严重限制了它在辅助降糖保健食品的中应用。实验优化了氨水联合有机溶剂提取GTF的方法。通过两级分子筛联用对GTF进行纯化,得到纯度较高的GTF。采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)联用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)技术对GTF中铬价态进行分析鉴定。结果表明,富铬酵母粉经0.1 mol/L氨水振荡提取4 h后,上清液再经30%乙醇静置20 min,离心收集上清液。该粗提液中铬含量为133μg,铬蛋白比为5.015;相比与氨水提取法(铬蛋白比0.804),氨水联合有机溶剂法的铬蛋白比提高了6倍,提取效率提高极大。GTF粗提液再经两级葡聚糖凝胶层析柱分离纯化,得到了一个与铬峰重合的蛋白峰。利用HPLC-ICP-MS对其进行铬价态分析,图谱显示GTF样品中铬出峰的时间为31~90 s,出峰时间与Cr(Ⅲ)的出峰时间一致,有且只有一个铬峰,GTF中的铬是以Cr(Ⅲ)形态存在,无Cr(Ⅵ)存在。该结果为GTF保健食品或安全膳食铬补充剂的开发提供了理论依据。     

GTF高产酵母菌体中铬元素的分布规律

应用先进材料学分析的手段并结合生物电镜技术,对酵母生物富铬过程中细胞的变化以及铬在细胞中分布进行探究,揭示酵母富铬机理。以不同剂量的铬处理酵母细胞,利用扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察酵母细胞吸附Cr3+形成GTF过程中细胞形态变化;利用能谱分析仪-透射电子显微镜(EDS-TEM)、飞行时间二次离子质谱仪(TOF-SIMS)分析铬在酵母细胞中的分布;采用EDTA洗脱法和原生质体制备法对酵母细胞进行组分分离,用火焰原子吸收法测定其各部位的铬含量,印证能谱及质谱的测定结果。结果表明:随着培养基中Cr3+质量浓度的升高,酵母细胞形状由规则的椭圆形变成长轴拉长的椭圆形;并且在Cr3+质量浓度为500,800μg/mL时,表面出现沉淀,内部出现空泡。当Cr3+质量浓度为500μg/mL时,酵母细胞吸附的总铬和有机铬含量均最高,分别达到1 803.87μg/g·DCW(Dry Cell Weight)和1 133.91μg/g·DCW。其中吸附的总铬有14.43%集中在细胞壁,另外85.57%集中在原生质体,且原生质体吸附的铬中有73.29%以有机铬的形式存在,结合原生质体与细胞壁的质量比约为5∶1,可得铬在YSI-3.7细胞壁和原生质体空间分布均匀。EDS-TEM和TOF-SIMS的结果,进一步验证了这个结论。