酶解制备苦荞蛋白抗氧化肽及其分离纯化研究

以苦荞麦粉为原料,提取苦荞蛋白,分别采用碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶对蛋白进行酶解,采用DPPH法比较不同酶解产物的抗氧化活性,从而筛选水解制备苦荞蛋白抗氧化肽的最适酶。以水解度为指标,利用单因素试验和响应面法优化酶解工艺条件。结果表明,不同蛋白酶酶解产物的抗氧化活性大小为:胃蛋白酶胰蛋白酶碱性蛋白酶,其中胃蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率最高,为68.47%。胃蛋白酶最佳水解工艺条件为:时间2.5 h、温度38℃、pH 2.0,在此条件下苦荞蛋白水解度为32.68%。采用超滤对苦荞蛋白水解物进行分离纯化,结果表明,分子量3 kDa的水解物具有显著的抗氧化活性;经凝胶过滤色谱进一步分离得到3个峰,小分子量峰组分显示出最强的抗氧化活性。     

中性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化肽的工艺研究

试验研究了采用中性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化性肽的最佳工艺。将螺旋藻破壁离心后,用中性蛋白酶水解,以·OH清除率、DPPH·清除率和总还原力为评价指标,在单因素试验基础上,进行了正交试验,确定了最佳酶解工艺条件。试验结果表明,中性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化肽的最佳工艺条件为:酶解温度为60℃、[E]/[S]为3%、p H为7.3,时间为4 h。此条件下螺旋藻中性蛋白酶的水解物的·OH的清除率是92.790%、DPPH·的清除率为18.941%,代表总还原力大小的吸光度为1.507。     

响应面法优化草菇抗氧化肽的酶法制备工艺

以草菇为原料提取蛋白质,蛋白酶酶解蛋白制备抗氧化肽。以DPPH自由基清除率为指标,在单因素实验基础上,结合响应面法优化草菇抗氧化肽的提取工艺。通过超滤分离纯化获得不同分子量的肽段,采用DPPH自由基清除率、Fe2+螯合率和还原力法测定超滤组分的抗氧化活性。结果表明:中性蛋白酶为最优酶解蛋白酶,最佳酶解工艺条件为酶解时间3.70 h,加酶量3.81%,底物质量浓度3.11 g/100 mL,在此条件下,酶解产物的DPPH自由基清除率为69.85%±2.52%。通过超滤分级制备所得分子量最小的肽段F1（<3 kDa）具有最高的抗氧化活性,其DPPH自由基清除率、Fe2+螯合率和还原力分别为78.81%±1.56%、91.05%±1.65%、0.47±0.02。草菇抗氧化肽可作为潜在的天然抗氧化剂来源得到开发利用。     

响应面法优化坛紫菜抗氧化肽酶法制备工艺

以坛紫菜为原料,通过酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和纤维素酶酶解制备活性肽,以DPPH自由基清除率和多肽得率为评价指标,研究坛紫菜水解肽的抗氧化能力。结果表明:5种酶的酶解产物都具有抗氧化能力,中性蛋白酶酶解产物DPPH自由基清除率最高,选择它为最佳工具酶。通过单因素和响应面试验优化酶解工艺,得到最佳酶解工艺:酶解时间3.6 h、酶解温度47℃、酶用量16362 U/g、底物浓度3.0%、pH7.0。此条件下制备得到的水解肽具有较强抗氧化能力,DPPH自由基清除率可达(91.83±0.81)%。     

多宝鱼不同水解物肽段组成及体外抗氧化活性比较

为研究熟化、模拟消化和酶解对多宝鱼肉水解物抗氧化活性的影响,本研究分别采用碱性蛋白酶和胃蛋白酶-胰蛋白酶水解多宝鱼生肉和熟肉,制备生肉碱性蛋白酶水解物、熟肉碱性蛋白酶水解物、生肉体外模拟消化产物和熟肉模拟消化产物,并评价其水解度、相对分子质量分布、氨基酸组成、肽段组成和体外抗氧化活性的差异。结果表明:生肉碱性蛋白酶水解物的水解度最高,为20.18%;4种水解物的分子质量分布差异明显,共有肽段仅有1条,但氨基酸组成没有显著性差异;碱性蛋白酶水解物以肽段小于1000 Da的组分为主,2～4肽的含量达64.57%～51.73%,而模拟消化产物中1000～3000 Da的组分占比超过50%,以多肽(>10)为主,熟化过程会减少小肽(<6)的比例;体外抗氧化活性分析显示,碱性蛋白酶水解物的抗氧化活性均高于模拟消化样品,熟化会降低生肉碱性蛋白酶水解物的抗氧化能力,生肉碱性蛋白酶水解物具有最高的超氧阴离子和羟基自由基清除能力,以及最佳的铁离子还原能力。因此,碱性蛋白酶是优于模拟消化的多宝鱼蛋白水解方式,鱼肉的熟化总体上会降低水解物的抗氧化能力。     

海蜇低分子肽制备及体外抗氧化活性

目的 优化海蜇低分子肽制备工艺,评价其抗氧化活性及分析氨基酸组成。方法 海蜇利用碱性和中性蛋白酶双酶分步酶解制备海蜇肽, 以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除率为指标, 响应面实验优化酶解工艺条件。采用超滤技术,获得分子量≤3.5 kDa 海蜇低分子肽（low molecular weight peptide from Rhopilema esculentum Kishinouye, RKLP）。通过测定DPPH自由基、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]自由基及超氧阴离子（O2-）自由基的清除率, 评价RKLP抗氧化活性。氨基酸分析仪分析RKLP氨基酸组成。结果 酶解制备海蜇抗氧化肽的最佳工艺条件为：酶解温度50 °C、3%碱性蛋白酶pH 7.5酶解2 h、1%中性蛋白酶pH 7.0酶解2 h,所得的DPPH自由基清除率为71.52%±0.59%,接近与预测值70.57%。RKLP水解度为62.1%±0.57%,具有较强的DPPH自由基、ABTS自由基及O2-自由基的清除能力,表明RKLP具有较好的抗氧化活性。RKLP氨基酸种类丰富,必需氨基酸含量达29.87%,蛋白质营养价值较高,且含有较多的与抗氧化活性密切相关的疏水氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸和芳香族氨基酸。结论 优化海蜇酶解工艺条件,超滤制备的RKLP具有较强的抗氧化活性及较高的水解度,初步阐释其抗氧化活性机制,为海蜇高值化应用提供一定的理论依据。     

油莎豆粕抗氧化肽的制备及其稳定性研究

采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对油莎豆粕蛋白质进行复合酶解制备油莎豆粕抗氧化肽,以DPPH自由基清除率为指标,确定制备油莎豆粕抗氧化肽的最佳条件。此外,评价了油莎豆粕抗氧化肽的体外抗氧化活性和稳定性。结果表明,制备油莎豆粕抗氧化肽的最适条件为碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶=1∶1,酶的质量分数5%、底物质量浓度46 mg/mL、酶解温度61.7℃、酶解pH 6.7、酶解时间2.5 h,在此条件下,DPPH自由基清除率为88.45%。油莎豆粕抗氧化肽的体外抗氧化活性优良,当油莎豆粕抗氧化肽为5 mg/mL时,DPPH·清除率达88.69%、·OH清除率为42.57%、O■清除率为39.17%、ABTS自由基清除率达87.98%,还原能力为0.2627。油莎豆粕抗氧化肽具有热稳定性及冻融稳定性,在酸性和中性条件下稳定,但不耐受碱性条件,经胃肠消化后,活性下降比较明显。     

酶解水牛奶酪蛋白制备抗氧化活性肽工艺的研究

以水解度、还原能力和DPPH自由基清除率为检测指标,比较筛选碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解水牛奶酪蛋白制备抗氧化活性肽,筛选出中性蛋白酶是最适用酶。应用单因素和响应面法对酶解工艺进行优化。结果表明:中性蛋白酶酶解酪蛋白的最佳工艺参数:pH为6.9,温度为46℃,酶与底物浓度比为4.6%,酶解时间4.0h,此时10mg/mL酶解物的还原能力为0.457。实测结果与预测值符合性良好。     

水牛奶乳清蛋白制备抗氧化活性肽工艺的研究

实验是以水牛奶为原料,分离纯化后得到乳清蛋白。利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶5种不同的蛋白酶对水牛奶乳清蛋白酶解以制备抗氧化活性多肽。酶筛选结果显示,中性蛋白酶是最适宜酶解水牛奶乳清蛋白制备抗氧化活性肽,其酶解液的还原能力和DPPH自由基清除率较其他4种酶高。探讨酶解反应时pH、温度、时间、酶浓度对酶解反应的水解度、酶解液的还原能力和DPPH自由基的清除率的影响,在单因素试验基础上,采用响应面法对酶解工艺进行优化。结果表明,中性蛋白酶酶解乳清蛋白的最佳工艺参数为:pH为7.4,温度为50.5℃,酶与底物浓度比为2.1%,酶解时间5.0h,此时2mg/mL酶解物的DPPH自由基清除率为32.58%。实测结果与预测值吻合效果良好。     

大米蛋白的提取及抗氧化肽的制备工艺

本文以DPPH清除率为指标,研究不同蛋白酶、酶解温度、酶解时间和加酶量等因素对大米蛋白酶解产物的抗氧化活性影响,并采用L9(34)正交试验优化其酶解工艺。研究结果表明:中性蛋白酶是制备大米蛋白抗氧化肽的最佳水解用酶,其最佳酶解工艺为:酶解时间20 min,酶解温度50℃,加酶量4000 U/g。在此条件下,大米蛋白酶解产物的DPPH自由基清除率可达80.17%。     

体外模拟消化芝麻蛋白产生多肽的抗氧化性分析

为证实芝麻蛋白在人体内消化可产生抗氧化肽,采用体外模拟消化芝麻蛋白,分析芝麻蛋白水解产生多肽的组成与抗氧化活性。结果显示:在体外模拟消化模型中,芝麻蛋白在1 h内丧失原有亚基结构,最终水解为相对分子质量在15 kDa以下的多肽;水解产生的多肽具有抗氧化性,其中胃蛋白酶水解产生的多肽具有较强的DPPH自由基清除能力,而胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的水解有助于提升多肽的ABTS自由基清除能力。上述结果表明,芝麻蛋白在人体内消化会产生抗氧化肽,不同消化阶段的芝麻多肽组成有差异,从而造成抗氧化活性的差别。     

体外消化对金瓜籽抗氧化肽抗氧化活性的影响

本实验以金瓜籽为原料,以还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率为考察指标,采用响应面试验探讨了制备金瓜籽抗氧化肽的工艺参数,并研究了其经体外模拟人体胃肠道消化后的游离氨基酸组成、分子质量分布及抗氧化活性变化。结果表明：制备金瓜籽抗氧化肽的最优工艺条件为底物（金瓜籽粕）质量分数为6%、添加碱性蛋白酶3%、在pH?8.5的体系中55?℃酶解90?min,此条件下所得羟自由基清除率、DPPH自由基清除率、还原力分别为（58.19±0.80）%、（60.27±1.73）%和0.49±0.01;分子质量小于3?kDa、3～5?kDa及大于5?kDa的抗氧化肽经体外模拟胃肠道消化后分别含游离氨基酸41.72%、36.94%和33.93%,其主要为分子质量小于500?Da的肽段,占比分别为73.50%、60.15%和53.30%;与消化前相比,消化产物对羟自由基的清除能力分别提高了26.04%、29.06%和34.43%,还原力分别提高了50.98%、64.53%、67.35%。该研究可为金瓜籽抗氧化肽作为功能性抗氧化剂的生产和应用提供参考。     

生物解离大豆蛋白酶解物体外模拟消化抗氧化活性变化

挤压膨化大豆在生物解离过程中,通过酶解（碱性蛋白酶、风味蛋白酶）产生的大豆蛋白酶解物（soybean protein hydrolysate,SPH）有良好的抗氧化活性,因此,需要探索模拟胃肠道（gastrointestinal,GI）消化对蛋白酶解物抗氧化活性的影响。分别以蛋白酶（碱性蛋白酶、风味蛋白酶）酶解得到的SPH和经过模拟GI消化后的产物作为研究对象,采用水解度、氨基酸组成、分子质量分布、氧化自由基吸收能力（oxidative radical absorption capacity,ORAC）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力及2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt,ABTS）阳离子自由基清除能力对样品抗氧化活性进行分析。结果显示：相对于风味蛋白酶酶解,采用碱性蛋白酶进行酶解时抗氧化活性更高;但是经过模拟GI消化后,风味蛋白酶酶解得到的SPH抗氧化活性更高,ORAC为69.15 μmol/mg、DPPH自由基清除能力为27.29%、ABTS阳离子自由基清除能力为56.21%,肽的相对含量更高,为75.86%,并且肽中具有抗氧化活性的氨基酸含量更高,分子质量小于1 kDa的肽相对含量最高,为17.35%。     

酶解条浒苔蛋白制备ACE 抑制肽

为了开发利用绿潮藻类条浒苔中含量丰富的蛋白质,采用可见分光光度法测定酶解物对ACE的抑制作用,考察碱性蛋白酶、Alcalase和胰蛋白酶对条浒苔蛋白的水解作用及其水解产物的ACE抑制活性,筛选出Alcalase作为酶解条浒苔蛋白制备具有降血压活性酶解物的适宜水解酶。在单因素试验的基础上,采用响应面分析法对该酶的酶解条件进行优化。结果表明,最佳酶解条件为：料液比1:50、加酶量2982U/g pro、温度47.9℃、pH7.53、酶解时间90min,在该条件下,酶解物的ACE抑制率IC50值为0.66mg/mL。不同截留分子质量的组分中,分子质量范围在1～5kD,平均肽链长度为16的组分ACE抑制活性最强,模拟体外消化实验结果表明,分子质量小于10kD的组分具有一定的对消化酶的抗性。     

不同分子量红花籽抗氧化肽稳定性研究

目的:研究不同分子量红花籽蛋白抗氧化肽活性的稳定性。方法:以脱壳红花籽粕为实验材料,经复合酶酶解分离制备抗氧化肽,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH）自由基、超氧阴离子自由基（superoxide anion radical,O₂?·）及羟自由基（hydroxyl free radicals,·OH）清除能力为指标,探讨温度、pH、食品原辅料、金属离子及模拟胃肠消化等环境因素对不同分子量红花籽抗氧化肽活性的影响。结果:红花籽蛋白酶解物<3 kDa（SSPH-Ⅰ）、3~5 kDa（SSPH-Ⅱ）较分离前活性显著增加（P<0.05）,SSPH-Ⅲ（5~10 kDa）和SSPH-Ⅳ（>10 kDa）较分离前活性显著降低（P<0.05）,选取活性显著增加组分研究发现SSPH-Ⅰ抗氧化活性更加稳定,能在60~121 ℃高温、pH6~8弱酸弱碱条件下保持活性,各自由基清除率维持率达到90%以上,10 g/100 mL NaCl和葡萄糖、0.2 g/100 mL柠檬酸对SSPH-Ⅰ抗氧化活性有增强协同作用,各自由基清除率维持率增加至105%左右,10 g/100 mL的蔗糖和0.2 g/100 mL的防腐剂对活性影响不大,添加Cu2+、Zn2+和K+金属离子对SSPH-Ⅰ抗氧化稳定性显著下降（P<0.05）,其影响顺序为:Cu2+>Zn2+>K+>Mg2+>Ca2+,经模拟胃肠消化后活性较稳定,维持率为80%。结论:筛选得到<3 kDa红花籽蛋白抗氧化肽组分活性较高且稳定,为其工业化生产及应用提供理论依据。     

Effects of washing and membrane removal pretreatments on the antioxidant properties of grass carp (Ctenopharyngodon idella) protein hydrolysates produced by in vitro digestion

The effects of washing and membrane removal pretreatments on the antioxidant properties of grass carp protein hydrolysates prepared through in vitro digestion were investigated. Furthermore, antioxidant hydrolysate was fractionated using ultrafiltration membranes (10, 5, 3 and 1 kDa). Oxygen radical antioxidant capacity (ORAC), DPPH and ABTS‐scavenging activity in a gastrointestinal digest produced from pretreated minced grass carp was increased 1.74‐fold, 1.08‐fold and 1.72‐fold, respectively, compared to untreated minced carp. Compared to the alkaline protease hydrolysate, ORAC, ferric reducing antioxidant power, ABTS‐ and DPPH‐scavenging activity in a gastrointestinal digest prepared from pretreated minced carp were reduced by 11.5%, 60.9%, 16.3% and 78.4%, respectively. The ultrafiltration fraction (<1 kDa) displayed the highest antioxidant activity. The size of molecular weight and the amount of hydrophobic and aromatic residues in hydrolysates played an important role in antioxidant activity. Low‐molecular‐weight fish hydrolysates could serve as a potential source of functional ingredients for promoting health.     

复合蛋白酶水解玉米谷蛋白产物的抗氧化活性研究

以玉米谷蛋白为原料,利用复合蛋白酶对其进行限制水解,探讨不同水解时间所获得的谷蛋白酶解物的分子量分布和抗氧化活性。结果表明:不同水解时间获得的酶解物分子量分布差异较大。水解时间为120min的酶解物中,分子量分布为6 511.51~307.32Da的肽段占94.36%,此时获得的酶解物的抗氧化活性最高,其对DPPH自由基、O-2·、·OH的清除率分别为58.86%,82.64%,37.21%;还原力为0.236;与亚铁离子的螯合能力为29.92%。     

海洋鱼蛋白低聚肽结构和抗氧化活性的体外消化稳定性

本研究通过体外模拟胃肠道消化海洋鱼蛋白低聚肽,运用高效凝胶过滤色谱、紫外全波长扫描、圆二色光谱表征其消化前后结构变化,测定其消化前后DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除能力、铁离子还原能力(FRAP)及氧自由基吸收能力(ORAC)的变化,以探究模拟胃肠道消化对海洋鱼蛋白低聚肽结构及抗氧化活性的影响。分子量分布数据揭示了海洋鱼蛋白低聚肽中分子量为150～1000u的组分为其主要组成部分,所占比例最高可达88.39%;紫外全波长扫描、圆二色光谱扫描表明海洋鱼蛋白低聚肽对胃蛋白酶有很强的抗消化稳定性以及对胰蛋白酶有较好的抗消化稳定性。在浓度1～15 mg/mL范围内,海洋鱼蛋白低聚肽的DPPH自由基清除率与其浓度成正相关,最高为67.86%;ABTS自由基清除能力、FRAP值及ORAC值三个抗氧化指标均显示海洋鱼蛋白低聚肽在消化后其抗氧化活性均有一定程度的提高,其中ORAC值在先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后提高最显著(p0.01)。总之海洋鱼蛋白低聚肽的结构和抗氧化活性均具有抗消化稳定性。     

Functionalities and antioxidant properties of protein hydrolysates from the muscle of ornate threadfin bream treated with pepsin from skipjack tuna

Functional properties and antioxidant activities of protein hydrolysates prepared from ornate threadfin bream (Nemipterus hexodon) muscle, using skipjack tuna pepsin, with different degrees of hydrolysis (DH: 10%, 20% and 30%), were evaluated. Emulsifying and foaming properties of hydrolysates were governed by their DH and concentrations used. Hydrolysates with 20% DH had the highest scavenging activities for ABTS and DPPH radicals. However, chelating activity of hydrolysates for ferrous ion increased as DH increased. Size exclusion chromatography of the hydrolysate with 20% DH using Sephadex G-25 revealed that antioxidative peptides with molecular weight of approximately 1.3 kDa exhibited the highest ABTS radical-scavenging activity. In vitro simulated gastrointestinal digestion indicated that ABTS radical-scavenging activity of the antioxidative peptides was not affected by pepsin hydrolysis, whilst further digestion by pancreatin enhanced the activity. Therefore, protein hydrolysate from the muscle of ornate threadfin bream produced by skipjack tuna pepsin can be used as a promising source of functional peptides with antioxidant properties.     

优选南极磷虾蛋白肽抗氧化活性组分

目的制备南极磷虾抗氧化肽,优选出抗氧化活性最好的南极磷虾肽成分。方法采用脱脂、酶解、超滤等手段制备南极磷虾抗氧化肽;以DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、抗氧化能力指数3个抗氧化指标和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活力2个酶活力指标为评价指标,优选出抗氧化活性最好的南极磷虾肽组分;基于G-25凝胶层析技术对抗氧化活性最好的南极磷虾肽组分进行分离纯化,进一步基于电子顺磁共振(electron paramagnetic resonance,EPR)方法测定洗脱后各峰的DPPH自由基清除率,得到抗氧化活性最好的南极磷虾抗氧化肽组分。结果通过抗氧化指标测定,截留分子量3～10 KDa的肽的DPPH自由基清除率最高,为(30.10±1.10)%,截留分子量3 KDa的南极磷虾肽的ABTS清除能力和抗氧化指数较好,则IC50值为(0.74±0.08) mg/mL、氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)值为6.39±0.21;通过酶活力指标测定,截留分子量3 KDa的肽的SOD活力和CAT活力最好,分别为(45.7±0.13)U/mg和(17.1±0.19)U/mg蛋白质。对截留分子量3KDa和3～10KDa的南极磷虾肽进行G-25分离纯化后,测定各组分的DPPH自由基清除率,可知截留分子量3～10KDa的F2-2峰清除率最好,为(51.55±1.54)%。结论基于EPR方法优选出分子量为3～10 KDa的南极磷虾肽的F2-2组分的DPPH自由基清除率最高。