不同灭活方法在原生质体融合选育米曲霉菌株中应用的研究

实验选取生长速度快的米曲霉菌株AS3.951和产酶活力高的米曲霉菌株CICC2339为对象菌,通过探讨紫外、微波、超声波-热三种不同的物理灭活方法进行米曲霉的原生质体融合,并比较不同方法灭活后进行原生质体融合所得米曲霉融合菌株的性状。结果表明,AS3.951采用紫外灭活、CICC2339采用超声波-热灭活时其融合率最高为6.69%,以此方式筛选得到的融合菌株AC126、AC171产酶能力均高于产酶活力高的亲本菌株CICC2339,且遗传稳定。     

原生质体电融合选育米曲霉新菌株的研究

本实验对米曲霉AS3．951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用CRY-3型细胞电融合仪进行原生质体电融合。通过筛选得到EF113和EF222两株融合株,其酶活力分别达到了7680U/g和7200U/g,远高于酶活低的亲本菌株AS3．951。     

紫外灭活原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉AS3.951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合。从融合子中选出10株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,10株融合株的Hc值均比生长速度快而产酶量低的亲本菌株AS3.951大,菌株AC211、AC214、AC215、AC217、AC219的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

热-紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉（AS3．951）GIM3．13和CICC2339的原生质体分别进行热灭活及紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG（6000）作融合剂进行原生质体融合。融合实验最佳PEG（6000）浓度为35％,溶液pH值为7．5,融合率为4．24％。从融合子中选出17株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,其中8株融合株的Hc值明显比生长速度快而产酶量低的亲本菌株GIM3．13大,菌株16号的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

非对称灭活双亲原生质体融合法选育产果糖基转移酶的米曲霉新菌株的研究

本文以生产果糖基转移酶的米曲霉SBB201(Aspergillus oryzae SBB201)为出发菌株,通过紫外联合氯化锂诱变获得产酶性能与生长性能各自优良的米曲霉菌株UV-A与UV-B,采用非对称灭活法对这两株菌株的原生质体进行紫外以及热灭活双灭活,然后在PEG作为融合剂的介导下进行原生质体双亲融合,筛选出一株果糖基转移酶生产能力有较大提高的米曲霉新菌株,其酶活力达到了172.95 U/g,比出发菌株提高了64.57%。     

米曲霉双菌株组合制曲对产蛋白酶的影响

通过对2株米曲霉菌株进行组合制曲培养,以中性蛋白酶、氨肽酶为指标,得到制曲时间短、制曲中性蛋白酶和氨肽酶活性高的组合比例。将2株米曲霉菌株按合适比例进行组合制曲培养,检测中性蛋白酶和氨肽酶活力。在p H 7.2、30℃条件下对单菌株进行制曲培养,CICC2339和CICC2066菌株中性蛋白酶活力在42 h分别达到1187.7 U/g和830.8 U/g,其氨肽酶活力分别在42 h和60 h达到最高值93.2 U/m L和201.4 U/m L,最优组合菌株A6B4制曲42 h中性蛋白酶和氨肽酶活力最高分别达到1 366.8 U/g和148.7 U/m L,其中性蛋白酶和氨肽酶活力都较单菌株制曲具有优势。2株米曲霉菌株组合制曲能够缩短制曲时间,提高中性蛋白酶和氨肽酶活力,这些研究结果为米曲霉在食品发酵上的进一步了解提供帮助。     

米曲霉种内原生质体融合选育优良菌株

米曲霉HL和L5是来自酱油酿造企业的生产菌株。HL的生长速度快,而L5的中性蛋白酶活力高。以HL和L5为亲本,进行原生质体融合,筛选得到一株融合株R6。融合株比亲本株生长速度更快,孢子成熟时间快3h,中性蛋白酶活力分别比2株亲本菌株提高25.6%和19.9%,酱醅氨基氮值也比亲本菌株提高8%和5.6%。     

基于基因组改组的米曲霉沪酿3.042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件。以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株。其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定。     

基于基因组改组的米曲霉沪酿3．042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件.以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株.其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212 U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定.     

常压室温等离子体诱变技术选育曲霉型豆豉发酵菌种研究

为了提高曲霉型豆豉曲醅中蛋白酶活力,本研究对实验室前期筛选得到的一株蛋白酶活力较高的Aspergillus oryzae NCU-110为原始菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行诱变。结果表明:ARTP处理6min为最佳诱变时间,米曲霉致死率达到91.05%。对诱变处理的菌株进行两轮筛选及遗传稳定性验证实验后发现,突变株A.oryzae NCU-A55显示出高产中性蛋白酶活力和良好的遗传稳定性,酶活力较原始菌株提升了21.0%,达到741.6U/g;蛋白酶系对比实验进一步证实了突变株蛋白酶系以中性酶活力为主的特点,且酶系完整。在制曲60h后中性蛋白酶活力最高,达到958.8U/g,比原始菌株提升了14.7%;形态观察及产孢子能力对比,发现突变株具有菌丝生长速度加快、产孢子能力显著增强的有利表型。这些结果综合表明突变菌株A.oryzaeNCU-A55较高的产中性蛋白酶活性可能与其菌丝体快速生长及产孢子能力增强有关,且比较适合曲霉型豆豉的纯种发酵。     

米曲霉3.951菌株与RIB40菌株高产原生质体的制备及再生条件的研究

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是:以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是:以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。     

双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究

对双亲灭活米曲霉原生质体融合育种中原生质体制备的条件进行了研究,将菌丝的预处理与细胞壁的酶解合为一步,并讨论了DTT的加入量。结果表明,原生质体制备的最佳破壁酶为纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶3种酶混合浓度比为5:3:1;菌丝培养15h;酶解时加入3mol/L DTT;酶解2.5h;0.8mol/L NaCl作为渗压稳定剂。所得双亲菌株原生质体的融合率为3.31%。     

酱油多菌种制曲改善酶系组成的研究

通过对米曲霉3.042、黑曲霉3.350、根霉3.010进行混合制曲试验,以蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶为指标,研究不同比例、制曲温度、制曲时间对复合菌种酶活力的影响.结果表明,三菌种米曲霉3.042、黑曲霉3.350、根霉3.010的比例为3:2:0.5,制曲温度36℃,制曲时间48h,在此条件下,制曲酶系丰富,酶活力高...     

米曲霉产氯氰菊酯降解酶的条件优化

以分离自酱油曲中对氯氰菊酯有较强耐受性和较高降解能力的米曲霉J-3为研究对象,采用单因素试验考察了环境条件对其产生降解酶的影响,通过正交试验对其产氯氰菊酯降解酶的条件进行了优化。结果表明,当固体培养基装载量为15 g/250 mL锥形瓶、初始pH为6.5、氯氰菊酯含量为100μg/g、米曲霉J-3孢子悬液接种量为15%(V/m,浓度为107个/mL)、32.5℃培养120 h时,产生的氯氰菊酯降解酶活力达到27.42 U/mL。     

pH值及乳酸菌对米曲霉固态制曲过程的影响

考察了在固态培养条件下,不同的初始pH值及乳酸菌对米曲霉固态制曲过程的影响。以豆粕和麸皮(质量比为55∶45)为原料,1∶0.6的料水比,0.3%～0.5%的接种量接入沪酿3.042米曲霉种曲,33℃下制曲,定时取样测定固体曲的蛋白酶活力及孢子数。结果表明:适当偏酸性的环境有利于成曲蛋白酶的提高,培养基初始pH调节为6.5时米曲霉中性蛋白酶活力获得最大值(4 080±61)U/g干基,较对照组提高33%～37%;添加1.0%～2.0%乳酸菌,也同样起到改善米曲霉制曲过程的效果。     

单亲灭活德氏乳杆菌和乳酸乳球菌原生质体融合条件优化

利用单亲灭活原生质体技术对德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株的原生质体进行融合,考察原生质体制备、再生和融合条件的影响因素。结果表明:制备德氏乳杆菌FQ菌株原生质体最适条件为温度37℃,在含有10μg/mL变溶菌素和1mg/mL溶菌酶溶液中超声处理90min。在此条件下,原生质体再生率可达6.36%。乳酸乳球菌FL菌株添加1mg/mL甘氨酸处理后,用10mg/mL溶菌酶37℃恒温酶解90min,原生质体形成率可达99.97%。65℃处理乳酸乳球菌FL菌株原生质体120min,原生质体灭活率可达96.89%。融合实验结果表明,在PEG6000 400g/L(含0.02mol/L MgCl2和0.01mol/L CaCl2)、融合时间5min、融合温度20℃、pH6.5的条件下促融,德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株原生质体的融合率可达2.72×10-6。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

根据NCBI(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,以本实验室自行筛选的天然米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增出内切葡聚糖酶基因eg,将其定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,转化酵母宿主菌X33,刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65 ku。对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1 L三角瓶诱导培养5天达到最高酶活120 U/mL。对重组酶的酶学性质分析表明,其最适反应pH值和温度分别为pH4.0和45℃,在30～45℃和pH3.4～pH6.9范围内可保持内切葡聚糖酶最高酶活力70%以上。     

果胶酯酶的发酵培养基及培养条件优化

为提高果胶酯酶的产量,以果胶酯酶活力与生物量为指标,对塔宾曲霉CICC 2651产果胶酯酶的发酵培养基和培养条件进行了研究,通过单因素实验得到最优培养基和培养条件为:硫酸铵0.5%,果胶3%,Na₂SO₄ 0.04%,MgSO₄·7H₂O 0.04%,K₂HPO₄ 0.2%,培养温度30 ℃,初始pH为4.5,接种量5%,装液量40 mL。在优化工艺条件下,果胶酯酶活力达到1.53±0.09 U/mL,比初始条件提高了77.9%。通过发酵培养基和培养条件优化,塔宾曲霉CICC 2651发酵产果胶酯酶的能力大幅度提高。