乙醇脱氢酶Ⅰ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究

本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径,构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,以满足人们对低醇啤酒的需要.利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法,通过引物L1和L2扩增潮霉素B基因(两翼与酿酒酵母同源),按常规醋酸锂法转化酵母细胞后,筛选标记与酵母adh Ⅰ基因发生同源重组,得到一株ADH Ⅰ酶活性降低的工程菌株.发酵实验结果表明,转化菌株乙醇含量平均值为1.8%(V/V),较原始菌株低了65%.说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰.     

酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因反义干扰及对乙醇发酵的影响

通过构建酿酒酵母沉默表达载体PURH-ADH2,使ADH2基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。采用Bam HI和Xmal I限制性内切酶对SADH2基因和PURH质粒进行双酶切,构建反义重组表达质粒PURH-SADH2,通过高效酵母转化法和电转法将重组质粒组件转化至酿酒酵母SY01细胞中,获得阳性克隆菌株JY01。酿酒酵母JY01突变菌株与出发菌株SY01和Y01发酵试验结果相比,JY01甘油脱氢酶酶活比出发菌株Y01与SY01分别下降了16.31%和13.5%;当酿酒酵母Y01、SY01和JY01菌株发酵36~60 h时,JY01菌株甘油含量相比Y01分别下降了16.34%、14.25%、14.89%;当酿酒酵母突变菌株发酵48 h时,Y01、SY01和JY01的乙醇浓度分别为6.243 g/100 m L、7.145 g/100 m L和7.288 g/100 m L,酿酒酵母JY01发酵液乙醇量比比原始菌株Y01乙醇含量提高了14.33%。结果表明通过反义干扰ADH2基因5’UTR序列,能有效干扰酵母工程菌株ADH2转录与表达,削弱甘油积累途径,促进乙醇代谢途径。     

96孔板高通量选育产乙醇酵母

以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),安琪酵母(Angel yeast),酿酒酵母(Sacchro-myces cerevisiae)等4株菌为出发菌株,经过紫外诱变,96孔板高通量筛选出60株,复筛选出4株.最大乙醇产量提高到76.6g/L,糖醇转化率达到了0.488g/g.对上述4株菌进行耐乙醇性能驯化,发酵耐乙醇能力达到15%.     

利用96孔板和酿酒酵母生长圈复合筛选高产管囊酵母

野生酿酒酵母不能利用木糖作为碳源,但是可以利用乙醇作为碳源和能源。管囊酵母可以利用木糖生产乙醇。酿酒酵母可以利用管囊酵母生产的乙醇作为碳源。本研究将管囊酵母进行紫外诱变后,利用96孔板培养,选取OD值较高的孔进行酿酒酵母生长圈筛选。管囊酵母在木糖(5%)为唯一碳源的YNB培养基上生长并产生乙醇。产生的乙醇越多,指示菌酿酒酵母的生长圈相对越大。利用酿酒酵母生长圈法筛选的正变率为35.22%,筛出1株菌UV171,乙醇产量为10.7 g/L,比对照高25.9%,对菌株UV171进行稳定性实验,传至3代其产量稳定。     

以大豆糖蜜为原料高产乙醇酵母的筛选鉴定及其发酵特性研究

从大豆糖蜜中进行高产乙醇酵母的筛选和鉴定,并对其发酵特性进行研究。从大豆糖蜜中通过菌种的富集分离,TTC平板法初筛,耐乙醇能力及乙醇发酵能力的测定,筛选出一株乙醇产量达9.07%(V/V)的菌株P14。通过个体形态、菌落特征、生理生化及26S rDNA D1/D2区序列分析将菌株P14鉴定为酿酒酵母。研究了大豆糖蜜浓度及添加氮源和无机盐对酿酒酵母P14发酵生产乙醇的影响及酿酒酵母P14对大豆糖蜜中低聚糖的利用,结果表明大豆糖蜜浓度、添加氮源和无机盐对乙醇发酵影响显著,最佳的大豆糖蜜浓度为40%,添加氮源为1.2 g/L的蛋白胨;补加的无机盐为0.4 g/L MgSO4。在此培养基中发酵72 h后,糖蜜中90.10%的葡萄糖,91.23%的蔗糖,92.56%的棉籽糖和96.97%的水苏糖被酵母利用。因此大豆糖蜜中筛选出来的酿酒酵母P14具有较强的利用大豆糖蜜中的大豆低聚糖发酵产生乙醇的能力。     

桓仁产区优良冰酒酵母菌株的筛选及酿造特性评价（英文）

为获得可用于东北桓仁地区威代尔冰酒生产的酿酒酵母菌株,采用一种快速的酵母菌株筛选方法,通过测定菌株乙醇和二氧化硫耐受性,从威代尔冰酒自然发酵过程中筛选到9株酿酒酵母菌株。进一步酿造实验结果显示,所筛选的酿酒酵母可以顺利完成冰酒发酵,产生的香气轮廓与商业酵母DV10相比也不同(主成分分析结果),最终获得了2株具有高发酵活力且香气特征与商业酵母差异显著的酵母菌株SC42和SC45,其中SC42能够高产高级醇和酯类物质,并且低产乙酸,而SC45能够产生高含量的甘油、酯类物质以及反式玫瑰醚和β-大马士酮。结果表明,采用本研究的筛选方法能够快速有效地筛选到具有应用潜力的冰酒生产菌株,同时也证明了使用本土野生酵母菌株能够有效地改善冰酒香气品质,生产出与接种商业酵母不同风格的冰酒产品。     

构建ADH2和THI3基因敲除酿酒酵母用于降低糯米酒中高级醇的研究

为了降低糯米酒高级醇含量,以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株XF1的单倍体XF1a7和XF1α6为原始菌,采用Cre/loxP同源重组系统构建乙醇脱氢酶基因ADH2和类丙酮酸脱羧酶基因THI3缺失的单倍体酵母,再通过单倍体的杂交构建ADH2单基因缺失双倍体酵母XF1-A和ADH2与THI3双基因缺失的双倍体酵母XF1-AT。结果表明,重组菌XF1-A、XF1-AT与原始菌XF1的生长性能相似,菌株XF1-A和XF1-AT的基本发酵性能与菌株XF1无显著差异,菌株XF1-A酿造糯米酒中高级醇含量为522.16 mg/L,比菌株XF1低11.16%;菌株XF1-AT的高级醇含量为462.03 mg/L,比菌株XF1低21.39%。综上,ADH2和THI3基因敲除酿酒酵母能够有效降低糯米酒中高级醇生成量。     

基于生物量产率的低产乙醇酿酒酵母的筛选

目的:建立一种从酿酒酵母突变库中快速筛选低产乙醇酵母菌株的方法。方法:以转录因子spt15随机突变酿酒酵母文库为研究模型,以高生物量产率作为低产乙醇酿酒酵母的筛选标记,利用24孔板对spt15突变酵母文库进行初筛。对初筛获得的目标菌株,以乙醇产量作为筛选标记进行复筛,最终获得乙醇合成能力较低且生物量较高的酿酒酵母菌株。结果:(1)利用易错PCR技术构建了spt15随机突变文库,并将其转化至酿酒酵母YS59,获得酿酒酵母YS59 spt15突变文库;(2)经初筛,获得14株生物量产率≥70%的酿酒酵母YS59 spt15突变菌株;(3)通过复筛,筛选出编号712的低产乙醇突变菌株,其乙醇合成量降低了28.1%;(4)通过序列比对,发现spt15-712上有9个碱基发生突变,分别是A161G,T426C,T462C,T493A,A506G,T546C,T622C,T658C,A750T9。结论:成功建立了一种高通量筛选低产乙醇酿酒酵母的方法 ,并利用这种方法筛选出乙醇合成量降低28.1%的低产乙醇突变菌株。     

5 株低产乙醇的非酿酒酵母筛选及其酿造特性

为获得葡萄酒中低产乙醇的非酿酒酵母（non-Saccharomyces）菌株,首先采用纯种发酵方式对分离自湖南、辽宁和新疆的38 株本土非酿酒酵母进行产乙醇能力的评价。初步筛选到5 株乙醇体积分数、乙醇产率和潜在乙醇体积分数均低于酿酒酵母（S. cerevisiae）EC1118的菌株,包括红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）CVE-RM3、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）CVE-HU42、库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）CVE-PK1、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）CVE-MP33和葡萄园有孢汉逊酵母（H. vineae）CVE-HV6。进而将其分别与酿酒酵母EC1118进行混合发酵实验,评价其酿造特性。结果表明：CVE-HV6与EC1118混合发酵的降醇效果最明显,与EC1118纯种发酵相比,乙醇体积分数降低了0.72%。该混合发酵还能够增加葡萄酒中主要香气成分的含量,包括乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、2-苯乙醇和里那醇,提升比例分别为281.22%、3?503.87%、36.53%和49.03%,同时降低己酸和辛酸含量（分别下降86.60%和92.01%）,显著改善了葡萄酒的香气轮廓,提升葡萄酒花香和果香的浓郁度。综上,本研究筛选得到1 株能够低产乙醇且酿造特性优良的本土葡萄园有孢汉逊酵母CVE-HV6,为生产低醇葡萄酒提供了一种具有应用潜力的菌株。     

CRISPR/Cas9介导的酿酒酵母ADH2基因中断及反义RNA干扰GPD1的表达

CRISPR/Cas9是一个简单、高效的用于靶向目的基因和无标记的基因组工程的工具。本文通过构建酿酒酵母沉默组件PGK-SGPD1-CYC1,使甘油-3-磷酸脱氢酶I(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPD1)基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在中断乙醇脱氢酶Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ,ADH2)基因的同时,定点敲入GPD1基因的反义干扰组件,从而特定地干扰GPD1的表达。采用高效的酵母化学转化法将反应组件敲入酿酒酵母Y1H中,CRISPR/Cas9介导的同源重组效率达43.48%,由此获得了ADH2基因中断和GPD1反义干扰的酿酒酵母突变株。发酵实验结果表明,酿酒酵母突变菌株SG1-1与出发菌株Y1H相比,乙醇产率提高了9.07%,甘油产率下降了12.05%,乙酸产率下降了12.30%,结果表明通过中断ADH2基因及插入GPD1反义干扰组件,既能够中断ADH2基因的功能,减少乙醇转化为乙醛,同时也能在一定程度上干扰GPD1基因的表达,提高乙醇产率。     

啤酒酵母HD34-1乙醇脱氢酶活性的研究

菌株HD34-1是将B.sub的乙醇脱氢酶(ADH)基因转入啤酒酵母HD34而构建的无醇啤酒酵母工程菌株,该菌株的ADH基因受Gal启动子的控制,因此为了考察该菌株ADH基因的表达情况,本研究设计了半乳糖和乙醇的浓度梯度进行发酵试验并测定了相应条件下的的ADH活性,结果表明2%的半乳糖浓度,诱导16h最适宜ADH基因的表达。     

低频静电场辐射对酿酒酵母生长代谢的影响

为了探究低频静电场辐射对酿酒酵母生长代谢的影响和作用机理。本实验运用60 Hz低频静电场对酿酒酵母进行辐射处理,通过扫描电子显微镜、流式细胞仪、酶标仪和紫外分光光度计等仪器对酿酒酵母的生长趋势、形态特征、葡萄糖代谢、胞内蛋白总量和胞内乙醇脱氢酶的活性进行测定分析。结果表明:低频静电场辐射条件下生长的酿酒酵母缩短了生长迟滞期,加快了其对数生长期,且其生长速率相比自然生长提高了14.5%。辐射条件下生长的酿酒酵母对葡萄糖的消耗量在时间为16 h时比自然生长提高了15.64%,其胞内乙醇脱氢酶(ADH)的比活力比自然生长提高了7.25%,但胞内蛋白的总量无显著变化。因此,低频静电场辐射可影响酿酒酵母原有的代谢机制,对其生长代谢过程具有明显的促进效应。     

The alcohol dehydrogenase system in the yeast, Kluyveromyces lactis

We have studied the alcohol dehydrogenase (ADH) system in the yeast Kluyveromyces lactis. Southern hybridization to the Saccharomyces cerevisiae ADH2 gene indicates four probable structural ADH genes in K. lactis. Two of these genes have been isolated from a genomic bank by hybridization to ADH2. The nucleotide sequence of one of these genes shows 80% and 50% sequence identity to the ADH genes of S. cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe respectively. One K. lactis ADH gene is preferentially expressed in glucose-grown cells and, in analogy to S. cerevisiae, was named K1ADH1. The other gene, homologous to K1ADH1 in sequence, shows an amino-terminal extension which displays all of the characteristics of a mitochondrial targeting presequence. We named this gene K1ADH3. The two genes have been localized on different chromosomes by Southern hybridization to an orthogonal-field-alternation gel electrophoresis-resolved K. lactis genome. ADH activities resolved by gel electrophoresis revealed several ADH isozymes which are differently expressed in K. lactis cells depending on the carbon source.     

Identification of an NADH-dependent 5-hydroxymethylfurfural-reducing alcohol dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae

We report on the identification and characterization of a mutated alcohol dehydrogenase 1 from the industrial Saccharomyces cerevisiae strain TMB3000 that mediates the NADH-dependent reduction of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) to 2,5-bis-hydroxymethylfuran. The co-factor preference distinguished this alcohol dehydrogenase from the previously reported NADPH-dependent S. cerevisiae HMF alcohol dehydrogenase Adh6. The amino acid sequence revealed three novel mutations (S109P, L116S and Y294C) that were all predicted at the vicinity of the substrate binding site, which could explain the unusual substrate specificity. Increased biomass production and HMF conversion rate were achieved in a CEN.PK S. cerevisiae strain overexpressing the mutated ADH1 gene.     

Two genes encoding putative mitochondrial alcohol dehydrogenases are present in the yeast Kluyveromyces lactis

Four structural genes encoding isozymes of the alcohol dehydrogenase (ADH) system in the yeast Kluyveromyces lactis have been identified by hybridization to ADH2 DNA probes from Saccharomyces cerevisiae. In this paper we report on the isolation of KlADH4 and the complete sequencing of KlADH3 and KlADH4, two genes which show high homology to KlADH1, the ADH gene previously isolated in K. lactis, and to the ADH genes of S. cerevisiae. When compared with KlADH1, both KlADH3 and KlADH4 encode amino-terminal extensions which show the characteristics of the mitochondrial targeting sequences. These extensions are poorly conserved both at the nucleotide and the amino acid level. Surprisingly, the KlADH4 extension shows a higher identity at the amino acid level to the one encoded by ADH3 of S. cerevisiae than to the KlADH3 presequence. KlADH3 and KlADH4, in contrast to the ADH3 gene of S. cerevisiae, show a strong bias in the choice of codons.     

白云边酒优势酵母菌的分离鉴定及其发酵特征分析

从白云边大曲酒发酵堆积料和出池酒醅中共分离获得7株占优势的酵母菌,依次编号为Z1、Z2、Z3、Z4、BYB-2、BYB-3和FJ5。应用26S rDNA D1/D2区域序列分析,结果显示,Z1、Z2、Z3和FJ5属于东方伊萨酵母;Z4、BYB-2和BYB-3分别为热带假丝酵母、酿酒酵母和毕赤酵母。表明白云边大曲酒酿造过程中存在酵母菌的多样性,而优势酵母菌为东方伊萨酵母。对7株酵母菌进行耐高温、耐酒精能力以及酒精发酵产物的测定和分析,结果表明,东方伊萨酵母除具有一定的产酒精能力外,还具有耐热性好、耐酒精能力强和乙酸乙酯产生量高的特点。采用高粱为原料进行液态酒精发酵结果表明,Z1和FJ5菌株乙酸乙酯平均产量达到204.19mg/L。     

己酸菌对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响

将己酸菌与高产酯酿酒酵母在高粱汁培养基中进行混合发酵,研究己酸菌对高产酯酿酒酵母酒精发酵及酯醇代谢的影响。结果表明,己酸菌菌悬液对高产酯酿酒酵母的生长及代谢没有直接影响;己酸菌的代谢产物对高产酯酿酒酵母的发酵速度及酒精产量有所促进,在培养基己酸浓度为220mg/L时,酒精产量提高了6.63%;在己酸浓度为45~220mg/L时,高产酯酿酒酵母的乙酸酯类和主要高级醇受到的抑制作用逐渐增强,乙酸乙酯最多降低65.32%,乙酸异丁酯最多降低91.32%,乙酸异戊酯最多降低82.14%,高级醇最多降低71.14%;在己酸浓度为220mg/L时,与己酸浓度为0mg/L时对比,高产酯酿酒酵母共有1032个基因转录水平上调,有1037个基因转录水平下调,这些转录水平变化的基因主要涉及到高产酯酿酒酵母的氮代谢、糖酵解、苯丙氨酸代谢、碳代谢等多条代谢途径。