一株植物乳杆菌产苯乳酸特性的研究

研究了一株植物乳杆菌DL-13产苯乳酸特性,通过反相液相色谱对发酵产物进行了鉴定。结果表明:DL-13能还原苯丙酮酸生成苯乳酸,最佳发酵条件为:温度36℃,初始培养p H 7.0,苯丙酮酸浓度10 g/L,摇瓶转速为100 r/min。在此条件下24 h时获得最大苯乳酸含量为3.86 g/L,转化率达到38.6%。DL-13对其他底物如苯丙氨酸、苯丙酮酸钠、苯丙酮酸铵、苯丙酮酸钙等都具有一定的发酵能力。     

植物乳杆菌UN-30菌株高产苯乳酸的发酵条件优化

以实验室复合诱变的植物乳杆菌UN-30为出发菌株,采用响应曲面法对植物乳杆菌UN-30产苯乳酸的发酵条件进行了优化。在单因素试验基础上,采用4因素4水平Box-Behnken试验设计优化接种量、发酵温度、摇床转速及装液量,建立发酵条件的二次多项回归方程,预测得出在接种量5.03%,发酵温度32.19℃,摇床转速160.41 r/min及装液量40.57%时,苯乳酸产量最高。经试验验证,预测值与验证试验平均值接近,在最优条件下,应用反相高效液相色谱法检测植物乳杆菌UN-30菌株的苯乳酸含量,测得其苯乳酸产量达到2930 mg/L,与未优化前的712 mg/L相比,产量提高了4.12倍。表明在优化植物乳杆菌UN-30菌株的发酵条件后,使该菌株产苯乳酸的能力得到了提高,为苯乳酸的工业化生产提供优良菌种和基础数据。     

一株高产苯乳酸菌株的安全性评价与发酵工艺优化

该研究利用传统生物发酵技术生产苯乳酸,并对高产苯乳酸菌株种属、安全性以及发酵工艺进行研究。通过反相高效液相色谱法筛选得到1株高产苯乳酸菌株BLCC2-0069,该菌株发酵24 h后发酵液中苯乳酸的含量为1.26 g/L;借助菌株形态观察和16S r DNA序列鉴定,初步确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillu plantarum);该菌株培养4 h进入对数生长期,10 h进入稳定期,活菌数可达到1.78×109 cfu/mL。通过对该菌株的小鼠体内安全评价,初步确定该菌株的体内安全性。同时还对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069的发酵工艺进行研究,发现在培养基中添加3.00 g/L苯丙酮酸为底物时发酵液中苯乳酸产量最高可达3.96 g/L。综上,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069对小鼠无毒,具有较高生物安全性,直接发酵苯乳酸的产量可达到1.26 g/L,添加底物发酵苯乳酸产量可达到3.96 g/L。研究结果可为菌株的安全应用提供理论基础。     

基于超声法通透化处理提高静息细胞转化苯丙氨酸合成苯乳酸产量

由于底物和产物转运限制,重组大肠杆菌静息细胞转化苯丙氨酸合成苯乳酸的产量较低。针对上述问题,利用超声通透化处理静息细胞,提高静息细胞通透性,降低细胞屏障对催化作用的影响。使用超声破碎仪对静息细胞进行通透化处理,优化得到最佳超声处理条件：处理时间1 min、占空比80% 、功率30% 。对通透化细胞催化条件进行优化,得到最佳催化条件：pH7、35℃、缓冲液为磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）,最终苯乳酸的浓度从43.93 g/L提高到52.59 g/L,底物转化率从78.70% 提高到94.59% 。研究发现超声处理可以提高胞内苯丙氨酸、苯丙酮酸和苯乳酸的转运速率,从而提高整个反应的催化效率。该研究可为静息细胞催化过程细胞通透化处理提供理论指导。     

重组大肠杆菌全细胞合成苯基乳酸的研究

在E.coli BL21(DE3)中过量表达D-乳酸脱氢酶基因(D-ldh),并优化该重组菌全细胞转化苯丙酮酸钠合成苯基乳酸的条件。通过单因素实验和正交实验优化诱导表达条件,并在此基础上对全细胞转化苯丙酮酸钠合成苯基乳酸进行了优化。结果表明,菌体OD600为1.2时添加IPTG至终浓度0.2mmol/L,25℃诱导4h后收集菌体具有最佳转化活性;最优分批转化条件:p H7.0,8.0g/L苯丙酮酸钠,20g/L葡萄糖,1%(v/v)吐温-80,菌体浓度20g/L(干重),37℃,转速200r/min转化0.5h,苯基乳酸产量和转化率分别达到4.91g/L,56%。在上述优化条件上通过流加苯丙酮酸钠和葡萄糖,经6h转化,苯基乳酸最终产量达到17.23g/L,转化率为54%。研究结果表明该重组大肠杆菌成功转化苯丙酮酸合成苯基乳酸,具有较好的应用前景,为系统化代谢工程改造大肠杆菌生物合成苯基乳酸的进一步研究和应用提供了有用的技术参数。     

静息细胞转化合成苯乳酸的条件优化

研究利用乳酸菌静息细胞转化合成苯乳酸的条件.确定了静息细胞转化的菌龄后,用Plackett-Burman法从影响细胞转化的六因素中筛选确定菌体浓度、底物浓度和转化温度等三个主要因素,同时由Box-Behnken设计响应面分析和岭嵴分析来确定优化组合条件,实验结果表明:当转化条件为菌体浓度9.9%,底物浓度3.72g/L,转化温度33.4℃时,苯乳酸得率达极大值.此条件下,苯乳酸产量预测值为2.82g/L,验证值为2.88g/L.     

Lactobacillus plantarum苯丙酮酸还原酶的异源表达及其在苯乳酸制备中的应用

构建产苯丙酮酸还原酶的基因工程菌E.coli/ppr,优化其目的蛋白表达条件,并利用全细胞催化制备光学纯的D-苯乳酸。以Lactobacillus plantarum的基因组DNA为模板,经PCR扩增出一种编码苯丙酮酸还原酶的基因(ppr),并将其在大肠杆菌BL21中进行表达。以苯丙酮酸为底物,通过单因素和正交试验优化诱导表达条件,然后对E.coli/ppr全细胞制备苯乳酸的工艺进行研究。结果表明:E.coli/ppr在IPTG终浓度为0.5 mmol/L,20℃诱导8 h时具有最高的苯丙酮酸还原酶活性。由其催化制备苯乳酸的最佳条件为:反应温度40℃,反应初始pH 6.5,葡萄糖浓度20 mmol/L。在上述条件下增加苯丙酮酸的浓度至25 mmol/L,5 h后苯乳酸的最终产率达到98.4%,产物D-苯乳酸光学纯度ee99.9%。     

植物乳杆菌BLPC002产苯乳酸发酵培养基的优化

以L-苯丙氨酸为底物,对植物乳杆菌BLPC002产苯乳酸的发酵培养基进行了优化。通过单因素试验,研究了不同碳源及其他因素对苯乳酸产量的影响,采用Plackett-Burman试验设计法,从7个影响因素中筛选出苯丙氨酸、葡萄糖和牛肉浸粉3个主要影响因素,通过最陡爬坡试验和响应面法（RSM）优化了培养基的配方。结果表明,最佳培养基配方为苯丙氨酸8.3 g/L、葡萄糖30.0 g/L、牛肉浸粉1.8 g/L,优化后植物乳杆菌BLPC002产苯乳酸产量达到1.67 g/L,是优化前（0.36 g/L）的4.6倍。     

渗透化细胞转化生成苯乳酸的研究

Lactobacillus sp.SK007乳酸脱氢酶是催化苯丙酮酸转化生产苯乳酸的关键酶。实验中研究了渗透化剂对于Lactobacillus sp.SK007乳酸脱氢酶表观酶活的影响,优化了细胞渗透化处理过程;研究了pH和温度对于渗透细胞和粗酶液乳酸脱氢酶表观酶活及稳定性影响,优化了Lactobacillus sp.SK007渗透化细胞转化生产苯乳酸的工艺。渗透化过程:以2%乙醚为渗透剂,渗透时间2min,渗透化温度30℃;渗透化细胞转化生产苯乳酸工艺:苯丙酮酸底物浓度为5g/L,反应温度40℃,pH为6.0,转化时间为4h,PLA的产量达到3.38g/L。     

植物乳杆菌发酵生产苯乳酸的条件优化研究

苯乳酸(Phenyllactic Acid,PLA)能够抑制多种腐败菌与致病菌,具有抑菌谱宽、稳定性高、溶解性好等优点,是一种新型天然抑菌物质。以苯丙氨酸为底物,利用传统微生物发酵方法生产苯乳酸,并通过单因素试验、正交试验优化了发酵温度、pH、接种量和底物。结果表明,植物乳杆菌Lactobacillus plantarum AB-1发酵苯乳酸的产量随着发酵时间增加而增加,在24 h达到最大值,然后趋于稳定。植物乳杆菌Lactobacillus plantarum AB-1发酵生产苯乳酸的最佳条件为:发酵时间48 h、发酵温度37℃、初始pH6.4、初始接种量2%、苯丙氨酸添加量3.470 g/L,优化后苯乳酸的产量为(252.44±2.63)mg/L,与优化前(115.99±4.25)mg/L相比,产量提高了1.17倍。     

PH值及底物对副干酪乳杆菌发酵生产苯乳酸的影响

在7.5 L发酵罐中研究pH值及流加苯丙酮酸和葡萄糖对副干酪乳杆菌W2分批发酵产苯乳酸（phenyllacticacid,PLA）的影响。结果表明：发酵液初始pH值、底物葡萄糖和苯丙酮酸对菌体生长和产物产量都有影响。控制发酵液pH值为6.5,采用间歇流加苯丙酮酸及连续流加苯丙酮酸和葡萄糖,发酵36 h后PLA产量分别达到1.148 g/L和2.121 g/L,苯丙酮酸的转化率分别为62.19%和47.2%,与分批发酵相比分别提高41.72%和161.53%。     

产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及其发酵条件优化

以浆水作为菌株分离源,分离筛选产γ-氨基丁酸（GABA）乳酸菌,采用薄层层析法和高效液相色谱法定性定量分析GABA,并对筛选菌株进行形态学观察、生理生化试验及分子生物学种属鉴定、发酵特性分析及发酵条件优化。结果表明,共分离筛选出21株乳酸菌,具有产GABA能力的有6株,经鉴定其中5株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,1株为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentans）。选取GABA产量最高的一株植物乳杆菌,编号为2,通过单因素试验及响应面试验确定其最适发酵条件为：初始 pH值5.8,发酵温度36 ℃,发酵时间60 h。在此优化条件下,GABA产量可达0.78 g/L,比优化前产量（0.22 g/L）提高约3.5倍。     

响应面法优化重组大肠杆菌全细胞合成D-苯基乳酸

研究利用重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD全细胞生物转化苯丙酮酸（phenylpyruvic acid,PPA）合成D-苯基乳酸（D-phenyllactic acid,D-PLA）的条件。通过Plackett-Burman试验设计,从影响细胞转化的6 种因素中筛选得出转化温度、底物浓度和磷酸钠缓冲液pH值对底物PPA摩尔转化率有显著影响;采用Box-Behnken试验设计和响应面优化,对该重组菌全细胞转化合成D-PLA的条件进行了优化。最佳分批转化条件：转化温度为38 ℃、底物浓度为42 mmol/L、磷酸钠缓冲液pH 7.0、菌体质量浓度20 g/L、葡萄糖质量浓度20 g/L。在该条件下反应0.5 h,底物摩尔转化率为65.32%。根据此最佳转化条件,经4 h的间歇补加底物转化获得D-PLA最终浓度为119 mmol/L（19.75 g/L）,生产率为4.94 g/（L·h）。     

重组L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

乳酸脱氢酶是生物法转化苯丙酮酸为苯乳酸的一种有效的酶。实验克隆到一种新型L-乳酸脱氢酶基因ldhL,来源于Lactobacillus plantarumSK-2(植物乳杆菌SK-2),GenBank接受号为FJ392647。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析,约在37ku处出现显著的特征蛋白条带;重组LDH的比酶活为0.06U/mg。     

植物乳杆菌ZJ316高密度发酵条件优化

以1株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZJ316为研究对象,在MRS液体培养基的基础上,以吸光度值（OD600 nm值）为响应值,通过单因素试验及响应面试验对其高密度发酵培养基组分和培养条件进行优化。结果表明,L. plantarum ZJ316高密度发酵的最优培养基组成为蔗糖43 g/L、玉米浆干粉60 g/L、Na2HPO4-柠檬酸0.12 mol/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、MnSO4·H2O 0.10 g/L、吐温80 1 mL/L;最优发酵条件为接种量4%、发酵温度30 ℃、初始pH值6.5。在此优化条件下,采用发酵罐静置发酵24 h,植物乳杆菌ZJ316的OD600 nm值为5.13,活菌数可达8.01×109 CFU/mL,较优化前分别提高1.65倍、3.44倍。     

植物乳杆菌BLPC002产苯乳酸发酵工艺优化

为提高植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BLPC002发酵产苯乳酸,通过单因素试验和Box-Behnken试验设计对菌株BLPC002发酵产苯乳酸的工艺条件进行优化。结果表明,菌株BLPC002产苯乳酸最佳发酵工艺条件为：摇床接种量2.5%、转速200 r/min、装液量170 mL/500 mL和发酵温度33 ℃。在该优化条件下,苯乳酸产量为2.66 g/L,是优化前的1.6倍。     

黑枸杞乳酸菌饮料发酵工艺优化及功能性成分研究

以青海的黑枸杞为主要原料,以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为发酵菌种,制备黑枸杞乳酸菌饮料,并采用单因素试验和响应面试验优化其发酵工艺条件。结果表明,最佳发酵工艺条件为固液比1∶25（g∶mL）,植物乳杆菌接种量2.0%,发酵时间6 h,装液量40%。在此最佳条件下,黑枸杞乳酸菌饮料感官评分为9.3分,总糖含量为0.17 mg/mL,总酸含量为1.69 g/L,花青素含量为52.75 mg/L、总黄酮含量为0.07 mg/mL、总酚含量为0.99 mg/mL。     

不同乳酸菌发酵对菠萝浆品质的影响

以菠萝浆为原料,添加干酪乳杆菌、植物乳杆菌和肠膜状明串珠菌单一或复配发酵,测定发酵24 h后的蛋白酶酶活、超氧化物歧化酶（SOD）酶活、总酚含量、DPPH自由基清除能力、挥发性物质及冻干成粉后的维生素C含量。结果表明,乳酸菌单一发酵效果整体上要好于复配发酵,干酪乳杆菌单独发酵可使菠萝浆的SOD酶活保持在97.70 U/g,总酚含量达到最高（0.51 mg没食子酸当量（GAE）/g）;植物乳杆菌单独发酵菠萝浆时蛋白酶活性最好（821.00 U/mL）,同时DPPH自由基清除能力最高,达到5.37 μmol Trolox当量（TE）/g;肠膜状明串珠菌单独发酵组的维生素C含量最高,为4.73 mg/g;菠萝浆经干酪乳酸菌和植物乳杆菌单独发酵后,鉴定出的挥发性成分分别达到29和28种。综上,选择干酪乳杆菌或植物乳杆菌单独发酵菠萝浆能获得较好的品质。