微生物产弹性蛋白酶分子研究进展

本文从分子水平对微生物产弹性蛋白酶的研究概况进行了综述。内容包括不同菌源性弹性蛋白酶基因克隆、基因序列及功能分析、基因表达的调控、利用蛋白质工程对菌源性弹性蛋白酶进行改造,目的是从分子水平时弹性蛋白酶的转录表达、酶学反应机制进行阐释,最终提高酶的表达量,拓宽酶的应用范围。     

利用重组酵母菌株发酵混合碳源分泌表达角质酶

克隆来自Thermobifida fusca(嗜热放线菌)的编码角质酶基因tfu,并在N端人为添加了α-factor信号肽,以引导重组角质酶的分泌表达。在成功构建了重组菌株后,深入分析了半乳糖浓度对重组菌株表达角质酶的影响,并对诱导方式进行了优化分析。此外,还分析了混合碳源对重组菌株产角质酶的影响。依靠α-factor信号肽的引导,成功实现了重组酵母菌株角质酶的活性分泌表达。混合碳源实验表明,棉子糖和半乳糖的组合能够更好地促进角质酶的分泌表达,这为角质酶发酵生产及应用于食品医药及保健品行业提供了参考和借鉴。     

大豆β-淀粉酶基因在毕赤酵母中的高密度发酵表达

大豆β-淀粉酶在麦芽糖浆生产上具有应用优势。该研究应用毕赤酵母表达系统异源表达大豆β-淀粉酶,并对重组酶的酶学性质进行了分析,结果显示,其酶学性质没有改变。为了增强重组β-淀粉酶的表达,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导的毕赤酵母表达策略,10 L发酵罐发酵表达的重组β-淀粉酶酶活力为310 U/mL,比单一甲醇诱导提高了36%。研究结果表明,发酵条件优化对提高异源β-淀粉酶在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

菠萝泛菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因克隆、表达与酶活性分析

利用分子克隆的方法,对一种源于菠萝泛菌的内切葡聚糖酶(即β-1,4-内切葡聚糖酶)基因进行克隆、原核表达,利用Ni-NTA吸附柱对表达的重组内切葡聚糖酶进行纯化,分析重组酶的活性。研究结果显示,此重组内切葡聚糖酶含1个1 002 bp的开放阅读框,编码334个氨基酸序列,重组酶在大肠杆菌细胞中的表达量占可溶性蛋白的50%以上,经过纯化获得了纯度高于95%的内切葡聚糖酶蛋白,酶活力可以达到2 245 U/m L。     

Aspergillus ficuum内切菊粉酶基因在大肠杆菌中表达

研究内切菊粉酶基因在大肠杆菌中表达,利用基因工程的原理和方法,将来源于Asper-gillus ficuum JNSP5-06的内切菊粉酶基因(endoI)克隆到pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌经IPTG诱导后对表达产物进行酶活检测和酶水解产物分析。结果表明已成功构建表达载体pET28a-endoI,表达后的粗酶活为35 U/mL发酵液;重组酶水解菊粉的产物经TLC分析证实酶液具有内切菊粉酶活性,水解产物主要为低聚二糖、三糖和四糖。为其应用和工业化生产奠定基础。     

藤茶活性成分二氢杨梅素对明胶酶的影响

该文探讨藤茶活性成分二氢杨梅素（DMY）对明胶酶酶活性和酶蛋白表达量的影响。通过收集不同质量浓度DMY处理的人乳腺癌细胞的条件化培养液上清液,取等蛋白质含量各处理组样本液,进行相同条件的明胶酶谱实验,以此检测DMY对明胶酶蛋白表达量的影响;收集未经过DMY处理的细胞培养液上清液,等量体积上样进行明胶酶谱实验的SDS-PAGE电泳部分,移除凝胶中SDS后置于含有不同质量浓度DMY的孵育液中进行孵育,以此检测DMY对明胶酶活性的影响。结果表明,20-80μg/mL的DMY对明胶酶活性未见明显影响,但以剂量依赖方式抑制明胶酶蛋白的表达。这表明DMY抑制肿瘤转移的作用机制可能是通过抑制明胶酶酶蛋白的表达量,而不是通过抑制该酶活性来完成的。     

第一类整合酶表达载体的构建及鉴定

Inti1基因是编码整合酶的基因,采用PCR方法对Inti1基因片断进行扩增,扩增子采用Ned1和BamH1双酶切,并克隆到pET19b载体上.把构建好的载体转化至E.coli BL21(DE3)中,在IPTG下进行诱导表达.经SDS-PAGE电泳鉴定以及使用特异性抗His-整合酶单克隆抗体的Western-Bloting证明该重组E.coli BL21(DE3)-Inti1在IPTG诱导下可表达整合酶,此为整合酶表达调控研究奠定了基础.     

麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及其酶学性质研究

首先构建了来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)STB04的麦芽低聚糖生成酶(MFA酶)的枯草芽孢杆菌分泌表达系统,并对含表达载体的枯草芽孢杆菌WB600产重组酶的发酵条件进行了优化,发现以TB为发酵培养基、发酵温度为30℃时,有利于重组酶的分泌表达。其次,通过疏水和强阴离子交换色谱对重组酶进行了分离纯化,得到了电泳纯的酶。最后,对重组酶的酶学性质和产物合成进行了分析,结果显示:它在溶液中为单聚体,最适反应温度为45℃,且在该温度下半衰期为30 min;最适反应p H为6.5,且具有很好的p H稳定性;酶活力对金属离子存在一定依赖性并受Fe3+和Sn2+等重金属离子的显著抑制;重组MFA酶的动力学性质可以用米氏方程进行很好的描述,对麦芽糊精的水解速率最高;重组酶作用不同来源原淀粉及麦芽糊精的主要产物均为麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖,且以麦芽五糖为最高。     

酿酒酵母中的蔗糖转换酶基因(SUC2)研究进展

蔗糖转换酶基因(SUC2)编码蔗糖转换酶(Invertase),通过降解酵母细胞外的蔗糖成果糖和葡萄糖来提供酵母生长所需的碳源,在以蔗糖为主要碳源的培养条件下,蔗糖转换酶对于酵母生长必不可少.因此研究蔗糖转换酶基因序列、转录、调控等对酵母蔗糖代谢具有重要意义.蔗糖转换酶基因的表达受葡萄糖浓度、氧气和其在染色体上的位置等因素的影响.本文就葡萄糖浓度对SUC2表达的影响以及葡萄糖浓度对其表达调控的机制进行了综述,并展望了该基因及蔗糖转换酶在今后的应用和研究趋势.     

有机磷农药降解酶基因Oph2的克隆及甲基对硫磷降解效果研究

摘要：目的 挖掘可高效表达农残降解酶的基因,并构建含有该表达基因的工程菌,以此提供一种高效去除有机磷农残的新方法。方法 利用基因克隆获得高效表达农残降解酶基因Oph2,采用基因工程手段将其转化至毕赤酵母表达系统,对毕赤酵母的发酵产物进行SDS-PAGE定性研究和酶活定量研究,最后通过与目标底物甲基对硫磷反应,分析工程菌表达降解酶对有机磷农残的去除效果。结果 本研究成功克隆得到了高效表达有机磷降解酶基因Oph2,基因全长1000bp,编码256个氨基酸,酶蛋白分子量为37KD,并利用表达载体pPIC9K成功将其转化至毕赤酵母GS115。构建的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2表达有机磷降解酶活性为11.57 U/mL,对6.8 mg/L的甲基对硫磷降解效率为90%以上。结论 本研究得到的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2可高效表达有机磷降解酶,该酶活性高,对有机磷农残降解能力强,可有效应用于有机磷农残的降解。     

脱乙酰基酶在枯草芽孢杆菌中的高效可溶性表达

为提高脱乙酰基酶的可溶性表达含量,对前期挖掘的脱乙酰基酶NAP-Das2. 3基因进行异源表达及发酵优化。将脱乙酰基酶NAP-Das2. 3基因克隆至枯草芽孢杆菌表达载体p P43NMK的npr B信号肽下游,转入B.subtilis WB800构建了重组工程菌B. subtilis WB800/p P43NMK/nap-das2. 3,并对重组菌培养及发酵产酶条件进行了优化。重组菌最适培养和产酶条件分别为甘油6 g/L、牛肉膏30 g/L、Na Cl 10 g/L; p H 7. 5、培养温度37℃、装液量100 m L (500 m L摇瓶)、培养30 h。在优化的条件下,发酵液中脱乙酰基酶酶活达到106. 42 U/L,较出发条件提高了424. 68倍,在5 L发酵罐培养30 h后,脱乙酰基酶酶活达到116. 13 U/L。研究实现了脱乙酰基酶的异源高效可溶性表达,为脱乙酰基酶的应用提供了基础。     

山药黏液质及其酶解物的微观结构及免疫活性

从铁棍山药中提取黏液质,选取不同酶（胰蛋白酶、纤维素酶、复合蛋白酶）对其进行酶解,得到不同酶解产物,采用红外光谱和扫描电子显微镜技术,对黏液质及其酶解物的微观结构进行分析,同时采用体外细胞培养和实时荧光定量聚合酶链式反应方法,研究黏液质及其酶解物对脾淋巴细胞增殖转化及细胞因子mRNA相对表达量的影响。结果显示：黏液质及其酶解物,在微观结构上呈现很大差别;黏液质及其酶解物均能促进脾淋巴细胞增殖转化,但酶解物的促进作用强于黏液质;黏液质及其酶解物对Th1族细胞因子的mRNA表达促进作用显著高于对Th2族细胞因子的mRNA表达促进作用,使细胞中Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。     

转谷氨酰胺酶酶原在大肠杆菌中的重组优化表达

茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶酶原(pro-transglutaminase,pro-TG)在重组大肠杆菌中的表达量低,限制了其在食品、化妆品、纺织行业中的应用。通过对转谷氨酰胺酶酶原的基因序列进行密码子优化,降低其GC含量,提高了它在大肠杆菌中的表达水平,结果表明经优化后转谷氨酰胺酶原的表达量达到了优化前的4.4倍。为提高转谷氨酰胺酶的比活力,通过基于融合PCR的定点突变技术将转谷氨酰胺酶第二位的丝氨酸突变为脯氨酸,突变后转谷氨酰胺酶的比活力达到了突变前的1.26倍。上述研究结果表明,密码子优化及定点突变技术可以应用于优化转谷氨酰胺酶酶原在大肠杆菌中的表达。     

耐盐性谷氨酰胺酶在Bacillus subtilis 168中的整合表达

微生物质粒过表达外源基因,会由于质粒分离稳定性低、种子培养基中需添加抗生素等原因,限制其在工业生产中的应用。为了得到一株可用于工业生产谷氨酰胺酶的菌株,选择食品安全级Bacillus subtilis 168作为宿主,将来源于Micrococcus luteus K-3的编码耐高浓度盐的谷氨酰胺酶基因(Mglu)插入到其染色体上进行整合表达。选择了2个内源性蛋白酶基因作为整合表达位点,通过lox序列的重组消除抗性基因,得到无抗性基因的重组谷氨酰胺酶表达菌株。遗传稳定性研究表明,在不添加抗生素的条件下,通过连续传代重组菌株并测定发酵酶活,发现重组菌株连续传42代时,酶活基本不变。随后,采用5 L发酵罐对重组菌株进行分批补料发酵,最高酶活达到了41.5 U/mL。本研究对提高谷氨酰胺酶重组菌株遗传稳定性提供了借鉴。     

重组短小芽孢杆菌CotA漆酶的酶学性质及发酵优化研究

细菌漆酶具有良好的热稳定性和抗碱性环境能力,在工业废水处理和染料脱色方面具有很大的潜力。通过研究短小芽孢杆菌W3菌株的CotA漆酶基因在大肠杆菌中重组表达的酶学性质,对其发酵培养基进行优化,以提高产量。利用分子手段实现CotA漆酶基因在大肠杆菌中的重组表达,并利用BP神经网络建模和萤火虫算法寻优对CotA漆酶发酵培养基进行优化,最后重组表达的CotA漆酶进行染料脱色研究。结果表明,重组菌株表达的CotA漆酶具有良好的热稳定性和耐碱能力,最适反应pH值为3.5,最适反应温度为80 ℃。重组CotA漆酶对底物ABTS具有良好的亲和能力,Km为0.247 mmol/L,Kcat为41.32 s ^-1。在适宜条件下的重组CotA漆酶的表达量为1 915.3 U/L,使用BP神经网络和萤火虫算法优化培养基获得最佳的发酵培养基配方为：蛋白胨1.16 g/dL、酵母粉0.428 g/dL、NaCl 1.06 g/dL、CuSO ₄ 0.274 mol/L和甘油（体积分数）0.931%。优化过的培养基产CotA漆酶酶活为3 088.68 U/L,相比未优化之前提高了61.26%。重组表达的CotA漆酶对孔雀石绿和酸性蓝129脱色效果明显,达到90%脱色率。短小芽孢杆菌W3来源的CotA漆酶具有良好的酶学性质和工业应用前景。利用BP神经网络偶联萤火虫算法寻优是CotA漆酶发酵培养基优化的有效手段。     

酿酒酵母表面展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究

固定化酶是酵母表面展示技术的1个重要应用方向。本文应用食品级酵母展示表达系统进行表达,成功获得具有生物活性且固定在酿酒酵母细胞表面的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并测定其酶学性质。结果表明,与分泌表达的自由酶相比,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生了改变。其最适温度为60℃,热稳定性增强。50℃保温3 h,对酶活几乎没有影响。60℃保温1 h后的酶活为初始酶活的129.2%。随着该温度下保温时间的延长,酶活迅速下降,保温3h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%;1 h后酶活开始下降;70℃保温3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4~7范围内酶的稳定性较好。     

漆酶基因的克隆及其在产朊假丝酵母中的表达

为实现漆酶基因稳定高效的异源表达,利用基因工程技术构建同源整合表达载体pGQLR,删除其来自原核的DNA序列后电转化至产朊假丝酵母菌(Candida utilis,C.utilis),构建一株表达漆酶的产朊假丝酵母工程菌ZHQX1,并对其遗传稳定性和酶活进行评价.ZHQX1在连续传代100代时外源基因仍稳定存在,保持了...     

泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的克隆表达

目的:对植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因(nirS)进行克隆及表达,检测重组酶表达情况及其酶活力。方法:以分离自传统泡菜植物乳杆菌的基因组DNA为模版进行PCR扩增nirS;重组构建TA克隆质粒pMD 19-T-nirS,并转化到大肠杆菌DH5a中保存;通过双酶切消化将nirS基因连接到pET-32a(+)上,获得重组表达质粒pET-32a(+)-nirS,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;重组酶经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测其表达情况;重组酶经复性后检测其酶活力。结果:扩增得到nirS基因并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,所得重组酶以包涵体形式存在,酶活力为2131.5U/mg。结论:采用基因工程技术获得亚硝酸盐还原酶具有一定的应用前景。     

木聚糖酶融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

以来源于Aspergillus usamii E001的高比活木聚糖酶XynⅡ为亲本,采用"中心模板法"将耐高温木聚糖酶TfxA的前31个氨基酸连接在XynⅡ的N端,构建出融合木聚糖酶TPL。将TPL在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,并对表达条件进行了优化,对表达产物的酶学性质进行了分析。结果表明,融合酶TPL最适pH为4.6,最适温度为45℃,和XynⅡ保持一致,但热稳定性有一定提高,在50℃处理10min,TPL和XynⅡ的残余酶活分别为15.72%和6.92%。     

微滴数字PCR技术在多拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌筛选中的应用

为获得高产木聚糖酶酿酒酵母工程菌,利用rDNA整合法构建木聚糖酶酿酒酵母整合表达载体,实现木聚糖酶基因的多拷贝表达,并利用微滴数字聚合酶链式反应技术对转化子拷贝数进行检测,分析木聚糖酶基因拷贝数与酶活力之间的关系。结果表明：利用rDNA整合法获得了10?株不同拷贝数木聚糖酶酿酒酵母工程菌,对其酶活力进行测定,发现当拷贝数小于9时,菌株产酶能力随拷贝数增加而增强,9?拷贝数时菌株产酶能力最强,酶活力为308?U/mL,超过9?拷贝,产酶能力降低。