HDA法用于检测肉中金黄色葡萄球菌的研究

本文研究了猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法(HDA法),以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,通过赖解旋酶恒温基因扩增方法直接检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果表明,HDA法检测肉中金黄色葡萄球菌的特异性强,试验涉及的其它菌株未发生扩增,只有金黄色葡萄球菌得到与设计序列长度一致的216 bp基因片段,检出限为101 CFU/g,优化确定UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1 μg、5.0 μg,该方法用于检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的灵敏度高,耗时短,为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了新的方法,也为其它食品中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了基础。     

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的：建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法：根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果：解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0 μg。结论：解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。     

解旋酶恒温基因扩增方法快速检测酸乳中醋化醋杆菌

目的建立解旋酶恒温基因扩增方法(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)快速检测酸乳中醋化醋杆菌的分析方法。方法以醋化醋杆菌的16S-23S rRNA ITS序列为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,通过解旋酶恒温基因扩增方法直接检测酸乳中醋化醋杆菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果 HDA法检测酸乳中醋化醋杆菌的特异性强,实验涉及的其他菌株均未发生扩增,只有醋化醋杆菌得到与设计序列长度一致的197 bp基因片段,方法检出限为3.6×10~1 CFU/g,实验条件优化后T4 gp32、UvrD helicase的终含量分别为4.0、0.15μg。结论该方法灵敏度较高,时间较短,为酸乳中醋化醋杆菌的检测提供了新的思路,同时也为其他食品污染菌的快速检测提供了借鉴意义。     

利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分

以猪特异性基因序列为靶位点设计特异性引物,以常见畜禽肉包括猪肉、羊肉、兔肉、牛肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等参考动物肌肉DNA为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立猪源性成分荧光定量PCR检测方法;并将猪肉DNA模板浓度进行8个梯度稀释,检测其灵敏度。结果显示,该方法能够有效对猪源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高,可快速准确地鉴别畜禽肉中猪源性成分。     

荧光定量PCR方法检测畜肉食品中鸭源性成分

目的 建立一种快速、特异、灵敏的鸭源性成分检测方法。方法 本研究以鸭线粒体基因全序列为靶位点设计引物和探针, 进行荧光定量PCR扩增, 建立鸭源性成分检测方法; 以常见畜禽肉包括羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等参考动物物种作特异性检测; 以50 mg/kg羊肉DNA作为稀释液对鸭肉DNA进行梯度稀释, 做灵敏度检测。结果 该方法能够有效对鸭源性成分进行快速检测, 具有较强的特异性, 灵敏度较高(可达0.1 μg/kg)并且羊肉成分的存在对鸭肉灵敏度检测没有影响。结论 该方法特异性强, 灵敏度高, 可以快速、准确检测畜肉食品中含有的鸭源性成分。     

多重位点特异性PCR快速检测牛肉中常见掺假动物源性成分

目的:基于动物线粒体cytb基因的多态性位点,建立一种特异性多重PCR体系检测牛肉、猪肉和鸡肉的方法。方法:提取肉类的基因组DNA,利用不同物种mtDNA cytb基因序列的SNP位点的差异,设计特异性引物。进行多重PCR扩增,利用扩增产物片段大小不同,检测牛肉中常见的掺假动物源性成分。通过灵敏性试验,确定最低检测量。结果:实验设计的引物特异性良好,在同一反应体系中,在同一退火温度52℃条件下,牛肉DNA扩增后产生149 bp的特异性条带,猪肉DNA扩增片段为261 bp,鸡肉DNA扩增片段为554 bp,未发生非特异性扩增。且检测的最低浓度达到100 pg/μL,具有高度的灵敏性和适用性。结论:根据动物线粒体cytb基因的差异性位点,开发的多重PCR体系,可一次性地同时检测牛肉、猪肉和鸡肉,可快速、灵敏、高通量地分析食品中掺假动物成分的来源。     

基于线粒体16SrRNA基因鉴别畜禽肉中5种动物源性成分

目的:建立一种快速、特异、灵敏的动物源性成分检测方法。方法:以线粒体16S r RNA基因序列为靶位点设计特异性引物,以常见畜禽包括羊、牛、猪、兔、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑等参考动物为研究对象,提取肌肉组织DNA,进行PCR扩增,设计筛选羊肉、牛肉、猪肉和兔肉特异性引物对,并进行引物特异性研究。结果:选择的特异性引物能够有效地对包括羊肉、牛肉、猪肉、兔肉以及鸡肉在内的5种动物源性成分进行快速检测,方便简洁。结论:该方法可以快速、准确地检测畜禽肉中羊肉、牛肉、猪肉、兔肉和鸡肉成分。     

荧光定量PCR方法检测畜肉食品中猪源性成分

目的 建立一种快速、特异、灵敏的猪源性成分检测方法。方法 本研究以猪线粒体12S rRNA基因序列为靶位点设计引物和探针, 进行荧光定量PCR扩增, 建立猪源性成分检测方法; 以常见畜禽肉包括羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、鸭肉、兔肉、马肉、鹿肉等参考动物物种作特异性检测; 以50 mg/kg羊肉DNA作为稀释液对猪肉DNA进行梯度稀释, 做灵敏度检测。结果 该方法能够有效对猪源性成分进行快速检测, 具有较强的特异性, 灵敏度较高(可达0.1 μg/kg)并且羊肉成分的存在对猪肉灵敏度检测没有影响。结论 该方法特异性强, 灵敏度高, 可以快速、准确检测畜肉食品中含有的猪源性成分。     

基于HDA的超级细菌耐药基因NDM-1检测方法的建立

本研究以建立解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法为目的,选择三种超级细菌NDM-1基因(metallo-beta-lactamase 1 gene)为目的基因,设计并合成特异性引物,建立和优化了可快速检测该种基因的HDA检测方法。特异性和灵敏度检测结果表明:该方法对NDM-1基因检测具有特异性,最低检测限可达10fg/μL,灵敏度高于普通PCR。提示HDA是一种针对NDM-1的快速、灵敏、便捷的非PCR核酸扩增技术。     

肉制品中猪肉源成分的Proofman-梯型熔解温度等温扩增检测

建立一种基于Proofman探针（proofreading enzyme-mediated probe cleavage）的梯型熔解温度等温扩增（ladder-shape melting temperature isothermal amplification,LMTIA）方法检测肉制品中的猪肉成分。选取猪细胞核中的特异性基因PRLR为靶基因,设计LMTIA引物和Proofman探针。通过优化反应体系,对所建立的方法进行特异性、灵敏度和最低检测限结果评价。结果表明：所建立的Proofman-LMTIA方法可在30 min内完成检测;相对于从鸡肉、鸭肉、牛肉、羊肉、猫肉、狗肉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、小麦粉中提取的基因组DNA,可特异性检测猪基因组DNA;检测灵敏度为1 ng/μL,对人工模拟的混合肉样中猪肉的最低检测限为0.1%。所建立的Proofman-LMTIA方法对猪肉成分有较好的特异性,能够快速、准确检测出肉制品中的猪肉成分,可对猪肉掺假进行快速检测。     

双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交侧流条快速检测牛肉中的鸡、鸭、猪源性成分

目的? 建立快速、简便、经济的双拖尾重组聚合酶恒温扩增结合核酸杂交试纸条快速检测牛肉中鸡源、鸭源、猪源性成分的可视化检测技术。方法? 采用多重双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术(multiplex recombinase polymerase amplification,mRPA)与核酸杂交试纸条相结合。对鸡、鸭、猪线粒体D环区域设计特异性拖尾RPA引物,扩增出双拖尾的RPA产物。鸡、鸭、猪3个物种RPA产物的拖尾序列分别与红、黄、蓝三种颜色的金纳米探针和试纸条上的检测探针杂交,形成肉眼可见的红、黄、蓝三色条带,整个RPA扩增(15 min)和试纸条检测(5 min)过程在20 min内即可完成。结果? 该方法对牛肉中鸡、鸭、猪肉的检测限达0.01%,且仅对鸡、鸭、猪肉DNA有特异性,与其他10个物种的DNA均无交叉反应。采集50份市售牛肉样品,使用该方法进行真实性检测:10份牛肉干、10份生牛肉、10份酱牛肉中未检测出其他动物源性成分,10份牛肉馅料中检测出1份含猪源性成分,10份牛肉片中检测出1份含鸡源性成分。该方法与PCR结合凝胶电泳的检测结果具有很好的一致性。结论? 双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术结合核酸杂交试纸条具有特异性强、灵敏度高,操作简单的优点,可实现牛肉中鸡、鸭、猪源性成分的同时可视化快速检测。     

可视化LAMP检测常见肉制品中猪肉成分

根据GenBank中公布的猪线粒体色素细胞b基因序列设计6 条特异性环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,通过简化线粒体DNA提取步骤,优化反应体系,以常见的牛、羊、鸡、鸭、马、驴肉为阴性对照验证该方法的特异性,掺假率梯度稀释以验证该LAMP法的最低检测限,建立常见肉制品中猪肉成分的可视化LAMP检测方法。结果表明：该方法提取目的基因操作简单、稳定,该可视化LAMP检测法以4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚钠盐为指示剂,能准确检测出常见肉类中猪肉是否掺杂,检测结果肉眼可见,灵敏度为10 pg/μL。     

基于COI序列的DNA微条形码技术鉴别熟肉制品中11种肉掺假的研究

建立并优化了基于COI序列的DNA微条形码技术（mini-barcoding）检测熟肉制品中11种常见肉类掺假的方法。样品经超声与真空冷冻干燥处理,提取DNA模板和PCR扩增后,目标扩增物经切胶纯化后进行克隆测序,并将测序结果提交GenBank数据库Blast比对。筛选出适合猪、牛、羊、鸡、鸭、鸽子、马、驴、鹅、兔、鼠11种肉类的扩增的通用引物COI-A,对PCR扩增条件进行优化,并建立18个掺假模式,对低经济价值肉类（猪、鸡、鸭、马、驴、鼠）的掺入的最低比例进行考察。结果表明:11种熟肉的DNA经通用引物COI-A扩增后,其扩增效率均为100%,18个掺假模式中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类的最低检出比例为5%,而掺入鸡肉的最低检出比例为10%,而鹅肉、鸽子肉和兔肉的掺假模式中最低检出比例为10%;利用本方法检测30批次市售样品,发现有18批次的熟肉制品存在掺假情况。该方法前处理简单,灵敏度合适,重现性好,可作为高经济价值熟肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。     

PCR方法快速鉴别食品中肉的种类

本文针对食品中肉成分种类鉴别开发了一种快速灵敏的PCR检测方法,可检测食品中是否存在猪肉、牛肉、羊肉以及鸡肉等成分。采用微波助提法提取样品中DNA,简化了前处理步骤,可在短时间内完成从多种不同类型肉与肉制品中提取肉成分DNA。为了评价方法的可靠性与灵敏度,猪肉以及掺入了不同比例浓度猪肉成分的食品样品采用本方法进行了核酸提取与PCR分析。检测结果表明,方法可检测出低至含有0.5%浓度的猪肉成分的混合样品。随机抽取50份不同类型的市面食品样品,检测出5份食品含有猪肉成分,7份食品中含有牛肉成分,5份食品中含有羊肉成分。该样品前处理方法、DNA提取方法以及PCR检测方法可广泛应用于食品中肉成分种类的检测鉴别。     

2013年苏州地区肉及其制品掺假情况调查

了解苏州地区肉及其制品的掺假情况,通过对肉类种源与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品,为加强食品标签管理提供依据。方法 运用自建的动物源性食品种源判定Taqman实时荧光PCR检测体系对苏州地区的肉及其制品进行种源判定,与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品。结果 本次调查共检验涉及32个生产单位的90份样品,总不符合率为25.6%(23/90)。检测的44份牛肉及其制品中有12份与标签不符,8份用猪肉部分替代牛肉,1份以鸭肉部分代替牛肉进行销售;此外有3份不含有牛肉成分,存在猪、鸡、鸭源性肉类之外的肉类成分。共检测羊肉及其制品16份,有2份用鸭肉代替羊肉出售,3份羊肉样品中掺入了部分猪成分,其中1份样品还存在单个样品掺杂两种外源肉类的现象(猪源性和鸭源性)。检测猪肉及其制品19份,其中2份样品含有标签未注明的鸡肉成分。在所检测的11份混合肉类样品中有4份成分与标签不符,主要是以廉价的鸡肉取代/部分取代相对高价的牛肉和猪肉。结论 肉制品掺假情况明显,用猪肉、鸭肉部分代替牛肉和羊肉仍是主要的掺假手段,牛肉掺假样品主要是熟制牛肉制品,而火锅食用羊肉卷样品则是羊肉掺假高危品,开展肉制品摻假检测对规范肉制品市场具有积极意义。此外,3份未知种源成分的牛肉样品提示在现有检测基础上还需扩大检测范围,防患于未然。     

基于近红外技术测定不同鲜肉中挥发性盐基氮含量

目的 应用近红外光谱技术快速检测猪肉、羊肉和牛肉的挥发性盐基氮含量。方法 本实验采集各种肉类的近红外光谱, 运用偏最小二乘法(partial least squares, PLS), 光谱经多种不同预处理方式并通过比较选择最优处理后, 建立挥发性盐基氮含量的近红外校正模型。结果 猪肉选择一阶导、S-G平滑方式, 羊肉选择二阶导、S-G平滑方式, 牛肉选择一阶导、Norris平滑方式。猪肉、羊肉和牛肉的挥发性盐基氮建模集相关系数分别为0.9069、0.9106和0.9587, 方根误差分别为1.12、1.64和2.20。结论 所建立的模型取得了较好的结果, 验证了近红外光谱技术对猪肉、羊肉和牛肉挥发性盐基氮进行定量分析的巨大应用潜力。     

基于食品测色仪的肉色变化规律研究

目的 为实现仪器测定肉色的规范化、标准化提供参考依据。方法 采用食品测色仪研究了牛肉、羊肉、猪肉和鸡肉肉色L*、a*、b*、C*、h、L、a、b值随氧合时间及肉块厚度的变化规律。结果 时间方面, 鲜切牛肉在24~28 min, 鲜切羊肉、猪肉在8~12 min内各肉色指标均未发生显著变化(P>0.05), 鸡肉在0~40 min的测定过程中肉色比较稳定; 厚度方面, 牛肉、羊肉厚度由1.5 cm增至2.0 cm过程中肉色变化不显著, 而猪肉厚度增至2.5 cm之前肉色持续变化。结论 食品测色仪测定肉色的适宜条件为: 鲜切牛肉氧合24 min, 厚度不小于2 cm; 鲜切羊肉氧合10 min, 厚度不小于2 cm; 鲜切猪肉氧合10 min, 厚度不小于2.5 cm; 鸡肉不需氧合可直接测定。     

中国与主要发达国家牛羊禽肉与猪肉比价分析

分析了1995年以来美国、欧盟、日本、韩国和我国猪牛羊禽肉价格走势。除日本外,其余国家牛肉和猪肉价格均呈上涨趋势;美国、欧盟和中国羊肉价格以及美国、欧盟、韩国和中国鸡肉均呈涨势。日本和韩国牛肉/猪肉比价显著高于其它国家,总体呈降势,美国、欧盟和中国则呈增加趋势。我国牛羊肉/猪肉比价季节性不明显。我国和韩国鸡肉/猪肉比价处于低位。