不同补料发酵方式对重组毕赤酵母高密度培养的影响

目的:研究5L发酵罐中葡萄糖补料方式对重组毕赤酵母高密度培养的影响,为大规模工业化生产奠定基础.方法:葡萄糖分批发酵阶段结束以后,以不同的流加策略流加补料培养基.结果:分批发酵初始葡萄糖最佳浓度为10g/L;采用间歇补料和恒速流加补料方式培养毕赤酵母,发酵结束后菌体细胞干重分别为33.2g/L和41.5g/L,而采用指数流加补料方式,发酵前期和发酵后期控制比生长速率分别为0,20h-1和0.15h-1,发酵结束后菌体细胞干重可达53.4g/L.结论:采用分阶段控制比生长速率的发酵策略,发酵结束后菌体细胞干重远远大于间歇补料和恒速流加补料发酵策略.     

赖氨酸发酵工业化研究

以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）WSH L1为产生菌,研究确定了2.5 L罐赖氨酸流加发酵中氮源浓度的初始值及过程控制模式。首先分析了不同初始有机氮源浓度对赖氨酸流加发酵过程菌体生长、产物积累以及微生物稳定性的影响,并得到适宜的初始有机氮源浓度为20g/L;在流加糖液中添加10g/L的有机氮源使发酵产酸和产物对耗糖转化率分别达到109.0g/L和38.5%。在分析pH值反馈控制铵离子浓度时的发酵液硫酸铵浓度变化过程的基础上,提出了葡萄糖浓度反馈控制铵离子浓度的基质流加模式。对铵离子浓度采取复合反馈控制方式后,发酵64 h,赖氨酸盐酸盐浓度和产物对葡萄糖的转化率分别达到119.0 g/L和40.2%。     

重组毕赤酵母产凝乳酶发酵条件研究

以重组毕赤酵母GS115/pPICZaA-Prochy为凝乳酶生产菌种,研究其在5L发酵罐水平的最佳产酶条件,为中试生产提供依据.采用批量发酵,甲醇浓度0.1％,诱导阶段每12h添加10g/L蛋白胨,发酵液pH值为3.0,油酸浓度0.2％,诱导初期批量加入10g/L山梨醇共基培养,诱导84h可获得152SU/mL的酶活力.采用十二烷基磺酸钠-苯琼脂糖凝胶电泳分析,在发酵液(去菌体后)样品盐离子浓度2mol/L,流速2.5mL/min,酶回收率达到82％,浓缩倍数20倍.     

赖氨酸发酵工业化研究——赖氨酸流加发酵中氮源浓度的选择及控制模式

以黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)WSHL1为产生菌,研究确定了2.5L罐赖氨酸流加发酵中氮源浓度的初始值及过程控制模式。首先分析了不同初始有机氮源浓度对赖氨酸流加发酵过程菌体生长、产物积累以及微生物稳定性的影响,并得到适宜的初始有机氮源浓度为20g/L;在流加糖液中添加10g/L的有机氮源使发酵产酸和产物对耗糖转化率分别达到109.0g/L和38.5%。在分析pH值反馈控制铵离子浓度时的发酵液硫酸铵浓度变化过程的基础上,提出了葡萄糖浓度反馈控制铵离子浓度的基质流加模式。对铵离子浓度采取复合反馈控制方式后,发酵64h,赖氨酸盐酸盐浓度和产物对葡萄糖的转化率分别达到119.0g/L和40.2%。     

利用乳清为主要原料高密度培养干酪乳杆菌

利用乳清为原料高密度培养干酪乳杆菌(Lactobacillus casei STL3102),用于生产浓缩发酵剂.在5L发酵罐研究了pH控制和补料培养条件,结果表明,加碱控制pH对菌体生长有利,控制pH为6.0时的菌体干重最高.不同碱液对菌体的生长有显著影响,流加NH3·H2O菌体的产量较高,24h时菌体干重达3.74g/L.在流加NH3·H2O,控制pH6.0条件下,对菌体补料发酵进行了研究.采用30g/L为初始乳清浓度,发酵16h以1.0mL/min恒速补料,发酵44h,菌体干重达4.79g/L,此时测定发酵液中活菌数为1.95×1011CFU/mL.     

NH+4离子对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶发酵过程的影响

利用重组毕赤酵母在7 L的发酵罐中进行分批补料高密度发酵,考察不同NH4+质量浓度对毕赤酵母基因工程菌表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,补加(NH4)2SO4溶液维持NH4+质量浓度在7 g/L时华根霉脂肪酶酶活最高,分别是不补加(NH4)2SO4溶液、补加并维持NH4+质量浓度在5 g/L、10 g/L条件下的1.41、1.11、1.08倍,而且在该氮源质量浓度条件下,胞外总蛋白质质量浓度最高,达到5.61 g/L。通过分析不同氮源条件下发酵参数比生长速率、产物比形成速率和底物比消耗速率的差异,发现发酵维持NH4+质量浓度在7 g/L时,产物比形成速率和底物比消耗速率均较高,这与该条件下产酶水平最高相一致。研究结果表明,对毕赤酵母基因工程菌发酵过程中的氮源进行优化,能够明显促进外源蛋白质的表达。     

重组甘油单酯脂肪酶GMGL的高效表达及固定化

该研究以来源于海洋地衣芽孢杆菌的甘油单酯脂肪酶GMGL为研究对象,在5 L发酵罐中优化了重组大肠杆菌的发酵条件,确定了最佳诱导培养条件：诱导温度25 ℃,发酵培养基pH 7.0,发酵液菌体OD600达到20时添加IPTG至终浓度为1 mmol/L,葡萄糖流加方式为变速流加。诱导培养24 h,菌体湿重达到125.40 g/L,发酵液活力为1985 U/mL,较优化前（1185 U/mL）提高了67.50%。进一步对GMGL进行固定化研究,确定最佳固定化条件为：酶载量为100 mg/g,磷酸盐缓冲液离子强度为0.50 mol/L,pH为9,优化后固定化GMGL的活力为4770 U/g,较优化前（1650 U/g）提高了189.09%。利用扫描电镜（SEM）和傅里叶红外光谱（FT-IR）对固定化酶进行表征,证实GMGL成功负载在ECR8285上。上述结果表明将为高活力甘油单酯脂肪酶的高效制备提供了一定的研究依据。     

红酵母产生类胡萝卜素的研究注

研究了红酵母RY－98菌株产生类胡萝卜素的营养与环境条件,并对发酵过程生理现象的变化作了测试。结果表明：培养基组成、糖浓度和添加剂以及培养基初始pH值、通气量（摇瓶装量）与培养时间等,均对该菌细胞生物量和类胡萝卜素产量有影响,其中ZS添加剂的加入可以明显促进菌体类胡萝卜素的形成,这是本次研究的新发现,在初步优化的培养基组成（葡萄糖40g/L、玉米浆15g/L、（NH4）2SO42g/L、ZS添加剂1g/L）和培养条件下,菌体生物量与类胡萝卜素含量分别为27mg/mL和498.2μg/g,发酵液产色素能力为13.3mg/L。通过观测发酵过程生理现象的变化,认为该菌类胡萝卜素是菌体的次生代谢产物,主要形成于对数生长期的末期和稳定期。     

重组枯草芽孢杆菌分泌表达腺苷酸脱氨酶

目的：利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法：以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果：成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37 ℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到（2 230±50） U/mL。结论：本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。     

氮源对L-色氨酸发酵的影响

以L-色氨酸生产菌E.coli TRTH为供试菌株,研究了氮源对L-色氨酸发酵的影响。利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,确定了最佳有机氮源和无机氮源分别为酵母粉和硫酸铵,进一步确定酵母粉和硫酸铵的最佳用量为1 g/L和10 g/L,最后采用NaOH和氨水混合补料控制发酵液中NH4+浓度在120 mmol/L以下,发酵38 h,菌体生物量和L-色氨酸产量分别达到53.42 g/L和32.6 g/L,实现了大肠杆菌的高密度培养。     

High-level expression of recombinant human serum albumin from the methylotrophic yeast Pichia pastoris with minimal protease production and activation

The methylotrophic yeast, Pichia pastoris, is widely used as a host strain for the production of a variety of heterologous proteins. We used P. pastoris for the production of recombinant human serum albumin (rHSA). In several runs of fed-batch fermentation, rapid degradation of rHSA was observed, coinciding with a sudden increase of protease activity in the culture broth. Monitoring the changes in the concentration of the medium components during fermentation suggested that this phenomenon was caused by nitrogen starvation. Increased initial concentrations of ammonia and phosphoric acid in the medium prevented the protease production during fermentation. Using this improved medium, stable production of rHSA of around 1.4 g/l was achieved. Although protease activity in the culture broth of the improved medium was not detected by the casein plate method at the end of fermentation, potential protease activity remained and could be activated by decreasing the pH of the culture broth, a high degradation rate of 660 mg HSA/l/h was observed at pH 4.3, but degradation did not occur above pH 5.9.     

均匀设计法优化廉价型牛凝乳酶工程菌发酵培养基

为了获得生产用廉价型牛凝乳酶工程菌发酵培养基,通过单因素试验考察发酵培养基中各组分对产酶的影响。结果显示：葡萄糖、玉米浆、酵母提取物、尿素质量浓度对产酶影响显著。以上述因素作为随机因子,进行均匀设计试验,采用逐步回归方法对试验结果进行分析。结果表明：在葡萄糖45g/L、玉米浆17g/L、酵母提取物6g/L、尿素12g/L的条件下,凝乳酶活性达342.86SU/mL,比优化前提高了1.22倍。所得培养基为重组牛凝乳酶的高效低成本生产提供了参考。     

基因重组毕赤酵母产蛋清溶菌酶发酵工艺及表达条件的优化

以甲醇诱导型蛋清溶菌酶基因重组毕赤酵母（Pichia pastoris）NCY-2为研究菌株,选用麦芽汁为培养基,首先通过单因素试验,对培养基锥形瓶种类、原麦芽汁稀释度及外加氮源进行了优化,在此基础上,采用均匀设计试验,得到菌株NCY-2的最佳发酵工艺条件为发酵温度31 ℃、pH 5.5,转速220 r/min,接种量4%;蛋清溶菌酶最佳表达条件为诱导温度18 ℃、诱导pH 4.4、转速190 r/min、甲醇初始添加量为0.3%（之后每隔24 h分别添加体积分数1.0%、1.5%、2.0%,诱导72 h结束）。在此优化条件下,摇床水平发酵液中蛋清溶菌酶酶活力可达到962.4 U/mL。     

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究

考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。     

当量生物素控制对谷氨酸棒杆菌发酵产L-异亮氨酸的影响

以谷氨酸棒杆菌YILM 1504为出发菌,研究了生物素对L-异亮氨酸产量的影响。基于多梯度生物素对比实验及中后期生物素外源添加实验,确定了发酵液中最佳生物素浓度及补料工艺。结果显示:在低浓度生物素发酵液中,最适生物素浓度为45μg/L,此时产酸达到42.5g/L,糖酸转化率达到最高,为13.4%;在大于60μg/L高浓度生物素发酵液中,产酸最高为22g/L,表明高浓度生物素不利于产酸发酵。在5L发酵罐中,初始生物素浓度为30μg/L,18,32,42h分别添加10g/L玉米浆(15μg/L生物素),54h产酸量达到了44.5g/L,比初始生物素浓度为30μg/L,后期不补料产酸量提高了49.8%。     

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶培养基及发酵条件优化

对已构建好的表达谷氨酰胺转氨酶的大肠杆菌Rosetta DE3的摇瓶培养条件及发酵条件进行优化,所获优化培养基配方为葡萄糖4.0g/L,酵母膏3.0g/L,NH4Cl 4.0g/L,Na2HPO42.0g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4.7H2O 1.0g/L,NaCl 3.0g/L。得菌株发酵培养的最佳优化条件为装液量为25mL,接种量为5%,加IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为4h。     

From Food Waste to bioplastic: utilizing malt waste by Recombinant E.coli

From Food Waste to bioplastic: utilizing malt waste by Recombinant E.coli     

Physiological approach to heterologous human serum albumin production by Kluyveromyces lactis in chemostat culture

Production of recombinant human serum albumin (rHSA) controlled by the constitutive promoter phosphoglycerate kinase was studied in Kluyveromyces lactis. It was governed by both cell concentration and glycolytic flow. The triggering of the fermentation metabolism by unfavourable culture conditions (pH, pO₂, D) caused a decrease in the synthesis of the heterologous protein. The highest productivity (75 mg 1^?1 per h) and rHSA concentration (62 mg 1^?1) were obtained in chemostat culture with a dilution rate of 0·12 h^?1 and with 38 g 1^?1 dry weight.