赊店老酒窖池中产己酸菌分离鉴定及产酸条件研究

窖泥己酸菌是重要的窖泥产酸功能菌,所生成的己酸是生产浓香型白酒主体香气己酸乙酯的主要成分,将其应用于白酒的生产,可提高白酒的香气和质量。本研究从赊店老酒不同窖池的窖泥和黄水中筛选产己酸菌株并进行分离纯化,通过硫酸铜显色及气相色谱分析检测,初筛从118株菌株中获得了96株可产生己酸和丁酸的菌株,大部分为兼性厌氧型菌株。其中10株高产己酸菌经分子鉴定属于赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）,芽孢杆菌属（Bacillus）,拉梅尔芽胞杆菌属（Rummeliibacillus）,寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）,棒杆菌属（Corynebacterium）。己酸菌拮抗对峙实验结果表明10个菌株之间均无拮抗作用,可以进行混合培养。培养基中乙酸钠浓度从0.5%增加到1.0%时,产物中丁酸和己酸的总酸量最高,超过1.5%时己酸和丁酸的总量反而下降。74%的菌株在厌氧条件下产总酸量要高于好氧条件下产总酸量,厌氧条件下63%的菌株在30 ℃时产总酸量高于37 ℃时的产酸量。5株高产己酸菌在18 d发酵过程中菌浓度随着培养时间而逐渐增加,丁酸在发酵中期达到高峰并逐渐下降,己酸在发酵后期逐渐累积,产量最高达到3 g/L。     

白酒窖泥中蛋白酶产生菌的筛选及复配

从优质白酒窖泥中分离筛选出8 株高产蛋白酶的兼性厌氧细菌,通过测定内肽酶、氨肽酶、羧肽酶酶活力,最终筛选出3 株3 种蛋白酶活力相对较高的菌株HDS4、HDS6、HDS8,并对其进行形态观察、生理生化和16S rDNA鉴定,确定3 株菌分别为枯草芽孢杆菌（Baci l lus subt i l i s）、解淀粉芽孢杆菌（Baci l lusamyloliquefaciens）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。以接种量为基础,对3 株目的菌株进行复配,得到的复配菌系3 种蛋白酶活力均比单一菌株高,3 种酶活力分别提高了8.907%、6.181%、8.781%。     

窖泥中高产己酸功能菌的分离筛选及代谢功能的研究

窖泥是己酸功能菌繁衍栖息的场所。该研究从原酒车间老窖泥中分离筛选得到了高产己酸的复合功能菌株,命名为HJ31~#,该复合菌多数为革兰氏阴性杆菌。经条件优化及代谢功能研究,该复合功能菌的最适培养条件为培养温度34～36℃,最佳初始pH值为6.00～7.95,厌氧培养。在最适条件下,复合功能菌株HJ31~#的己酸产量均可达到1000 mg/100 mL以上。     

窖泥中己酸菌的筛选及其运用

筛选窖泥中己酸菌,为人工窖泥培养提供优质功能菌。采用厌氧法筛选己酸菌,结合生化和16S rRNA性质进行分析。从窖泥中筛选出Clostridium guangxiense strain xsk1和Clostridium kogasensis strain xsk2两株己酸菌,其相比Clostridium kluyveri菌株在遗传学地位上皆有显著差异。将这两株己酸菌在乙醇添加量0%、pH6条件下厌氧培养10 d后分析其代谢产物可知,均可产生己酸、丁酸、乙酸,同时其都能生成少量的己酸乙酯和丁酸乙酯,其中己酸产量分别为4.51 g/L、2.5 g/L。查阅文献可知,Clostridium guangxiense strain xsk1属于高产己酸菌,将其作为己酸菌来源培养不同载体的人工窖泥,发现培养两个月的粉末活性炭载体人工窖泥中,己酸菌数量为1.77×10~8cfu/g,并且该窖泥具有良好的发酵性能。     

己酸菌工业扩大培养条件的优化

从优质老窖泥中分离得到的一个高产复合己酸菌系,可用于人工窖泥培养及窖池维护。优化培养条件以获得最大己酸菌芽孢产量,在单因素实验的基础上,采用正交设计方法,确定工业扩大培养条件。研究表明：该菌繁殖的最适条件是：生长初始pH7.0、接种量10%、培养温度35℃、乙醇2.0%、NaAc1.0%、NH4Cl0.05%、CaCO30.8%,培养周期7d,在此培养条件下芽孢数可达4.01亿个/mL水平。     

金种子优质窖泥高产己酸菌的筛选鉴定及其应用性能分析

在浓香型白酒酿造过程中,窖泥作为酿酒微生物的重要载体对曲酒的酒体质量与风格特征具有重要影响。从优质窖泥中筛选高产己酸菌,并制备人工窖泥以提高酒体中己酸乙酯的含量或制备生产己酸乙酯产品等,对曲酒生产具有重要意义。本文通过富集培养、平板涂布、发酵液己酸含量检测、16S rDNA分析等方法,筛选鉴定高产己酸菌株,并考察培养温度、乙醇浓度、pH值等发酵条件,分析己酸菌液配方组分单因素含量影响等。结果表明,筛选得到的高产己酸菌JZZ,其液态发酵己酸平均产量为4.36 mg/mL,温度耐受区间为36~39℃,乙醇耐受浓度为2%~6%,己酸菌液配方组分添加量为硫酸镁0.01%,硫酸铵0.05%,磷酸氢二钾0.3%,乙醇2%,16S r DNA比对结果表明,JZZ菌株为克氏梭状杆菌(Clostridium kluyveri)。     

浓香型白酒窖泥中两株细菌的分离鉴定

从泸州老窖浓香型白酒发酵窖池的窖泥样品中分离出了2株细菌。经菌落特征观察和镜检后,利用Bi-olog微生物自动鉴定系统对菌株进行了鉴定,结果表明,XJ-01为Bacillus licheniforims(地衣芽孢杆菌),XJ-02为Bacillus(芽孢杆菌属)。     

窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究

浓香型白酒的主体香味物质是己酸乙酯,己酸菌是重要的功能菌种。该研究从优质窖泥中分离获得了高产己酸菌株,命名为JZZ,该菌是革兰氏阳性杆菌,经形态学和16S rDNA序列鉴定,属于克氏梭菌（Clostridium kluyveri）。通过培养条件考察,该己酸菌最适培养条件为接种量5%,装样量90%,培养温度37 ℃,pH值为6.5。在最适培养条件下,菌株JZZ的己酸产量均可达到4.36 mg/mL。     

浓香型白酒窖泥产酸菌协同发酵条件优化

浓香型白酒中己酸和丁酸的含量影响着己酸乙酯和丁酸乙酯的含量,从而影响白酒的风味。为提高浓香型白酒中己酸和丁酸的含量,本文以特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)、丁酸梭菌亚种(Clostridium butyricum subsp)3株窖泥产酸功能菌进行协同发酵;并将协同发酵产酸效果较好的SJ-1、SJ-3、SJ-8和优质窖泥富集菌液等量接种进行协同发酵,利用单因素试验优化其协同发酵产己酸和丁酸的发酵条件;通过部分因子试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken响应面试验设计模型优化己酸和丁酸的发酵培养基。优化结果为:接种量3%、培养温度28℃、发酵时间12 d、pH 6.4、蛋白胨5.10 g/L、乙酸钠5.04 g/L和丁酸钠4.45 g/L,在此条件下己酸和丁酸产量分别为1156.21 mg/100 mL、2345.84 mg/100 mL,比优化前提高了3.32倍、3.22倍。本研究以期为提高白酒风味物质和窖池养护提供理论依据。     

己酸菌的选育与应用研究

己酸菌是一种能够在培养液中积累己酸的功能菌。以优质大曲发酵池的窖泥为材料，采用厌氧培养分离方法筛选出己酸菌；进行耐热、耐酒精、耐pH及厌氧培养试验。可将选育出的己酸菌用于人工窖泥、窖池泥养护、翻沙材料及灌窖工艺中。(孙悟)     

浓香型白酒窖泥中产己酸菌的研究进展

酯类物质对浓香型白酒的口感和风味起到决定性作用,由产己酸菌产生的己酸和酒精作用生成的己酸乙酯是浓香型白酒的主要香体成分。产己酸菌是浓香型白酒窖泥中能够影响白酒风味的重要微生物。该文总结了浓香型白酒窖泥中产己酸菌的形态特征和代谢途径;不同培养条件如乳酸亚铁、不同碳源、不同氮源对产己酸菌的影响;对产己酸菌与酵母菌、放线菌以及产甲烷菌等不同菌种共培养以及产己酸菌在窖池养护等实际中的应用进展进行综述,为白酒窖泥中筛选优质的微生物菌种资源与白酒提质増香提供理论基础。     

窖泥酯化菌的富集筛选及其生长条件研究

以优质老窖泥为研究对象,厌氧条件下富集酯化菌,并对富集条件进行优化。通过传统培养分离法及顶空固相萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）法从优化富集液中筛选酯化菌,通过形态观察、生理生化试验及分子生物学技术对其进行鉴定,并研究其生长条件。结果表明,窖泥富集液培养20 d并富集2次有利于酯化菌的富集,从优化富集液中共筛选出3株产己酸乙酯和丁酸乙酯的厌氧梭菌。经鉴定,菌株Y1、Y2、Y3分别为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、Clostridium guangxiense、Clostridium sartagoforme,其中,菌株Y1的最佳生长温度为30 ℃、最适生长pH值为5;菌株Y2的最佳生长温度为34 ℃、最适生长pH值为7;菌株Y3的最佳生长温度为37 ℃,最适生长pH值为5,且3株菌株的最高耐乙醇体积分数达20%。     

响应面优化酿酒酵母与窖泥酯化细菌协同发酵产丁酸乙酯和己酸乙酯

为提高浓香型白酒发酵过程丁酸乙酯和己酸乙酯的生成量,以酿酒酵母和3 株窖泥酯化细菌为菌源,利用单因素试验和响应面法中的Box-Behnken试验设计模型优化己酸乙酯和丁酸乙酯的固态发酵条件。结果表明,水分质量分数、酸度和接种量对己酸乙酯和丁酸乙酯的影响极显著（P＜0.01）,而温度不显著（P＞0.05）。最佳发酵条件为温度32 ℃、水分质量分数78.00%、酸度2.60 mmol/100 g、接种量4.60%。在此条件下,己酸乙酯和丁酸乙酯的产量分别为9.55 mg/100 g和1.87 mg/100 g,分别达模型预测值的99.07%和100%。经反复验证,工艺合理可行,可为进一步提高浓香型白酒质量和窖泥功能微生物在生产实际中的应用提供理论基础。     

人工老窖退化预防及复壮措施

窖泥退化的主要原因有：窖泥配料不当，碳氮比失调；窖池防渗效果差，营养流失；工艺控制不合理，窖池管理不善等。规范工艺操作，强化窖池后期管理，用己酸菌液、窖泥营养液进行窖池养护及按期进行窖池窖泥大培养，可有效防止窖泥退化和提高复壮效果。复壮后的窖池发酵酒醅出酒率提高8．1％，己酸乙酯提高158mg／100mL，总酯提高275mg／100mL。     

一株产酸凝结芽孢杆菌的筛选及耐受特性研究

从散养鸡肠道内容物分离到5株溶钙圈较大的芽孢菌,经高效液相色谱（HPLC）测定筛选到一株产酸性能较好的菌株DPLY-7,综合菌落形态、生理生化及特异性序列分析等手段,确定其分类归属,并对其耐受特性进行了研究。结果表明,菌株DPLY-7被鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。在37 ℃培养10 h发酵液pH最低为5.04,其乳酸、乙酸含量分别可达2.60 mg/mL、1.24 mg/mL。菌株DPLY-7在pH值2.5环境中的存活率为79.76%,胆盐浓度0.5%环境中存活率为42.86%,可以耐受人工胃肠液及85 ℃水浴处理,是一株耐受性能优越的益生菌。     

丁醇高产菌株诱变育种及发酵条件优化研究

利用低温等离子体和亚硝基胍(NTG)对兼性厌氧产丁醇芽孢杆菌(Bacillus sp.)C2菌株进行复合诱变,分离筛选得到3株丁醇和总溶剂产量均有明显提高的突变菌株,其发酵7%玉米醪液后丁醇和总溶剂产量分别达到12.59g/L、12.44g/L、12.74g/L和20.36g/L、20.14g/L、20.79g/L,比出发菌株分别提高21.6%～24.5%和15.4%～19.1%.对编号为414的突变菌株发酵条件进行优化,在100mL三角瓶发酵体系中,该菌株的最适发酵条件为装液量100mL,种龄24h,接种量10%,pH 7(自然),37℃静置发酵72h,在此条件下,414菌株发酵7%玉米醪液产丁醇和总溶剂量分别达到12.58g/L～13.77g/L和21.25g/L～22.27g/L.     

云南牟定酸浆水中优势产酸菌的分离鉴定及生长特性

为挖掘自然发酵酸浆水中的优势核心产酸菌，分别从云南牟定两家腐乳生产企业自然发酵酸浆水中分离筛选到10 株产酸菌株，对其进行形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA测序分析，并对产酸较高的菌株进行生长性能分析。结果表明：云南牟定A公司生产腐乳的酸浆水中优势菌株分别为Lactobacillus fermentum（YQZ1）、Lactococcus raffinolactis（YQZ2）、Lactobacillus plantarum（YQZ3）、Enterococcus casseliflavus（YQZ4）、Microbacterium oxydans（YQZ5）；云南牟定B公司生产腐乳的酸浆水中优势菌株分别为Enterococcus faecium（XJZ1）、L. plantarum（XJZ2）、Lactobacillus paracasei（XJZ3）、Enterococcus hirae（XJZ4）、L. paracasei（XJZ5）。对分离到菌株的生长温度、生长曲线、产酸能力、耐酸能力、耐渗透压能力进行分析比较。XJZ4最适生长温度为32 ℃，其余菌株、自然菌群的最适生长温度均为37 ℃。菌株XJZ2生长速率最快，菌株YQZ1、XJZ2繁殖能力最强。菌株YQZ1、XJZ2产酸能力最强，有机酸累积量最多，48 h产酸量分别高达43.61、50.91 g/L。菌株YQZ3、YQZ5的耐酸性最强，菌株YQZ1、XJZ2耐酸性良好。菌株YQZ4在NaCl质量浓度为4 g/100 mL时仍能保持菌体浓度（OD600 nm）为1.53，其余菌株在NaCl质量浓度大于4 g/100 mL时生长受到明显抑制。菌株YQZ1、XJZ2具有较强的繁殖和产酸性能，用其混合菌种制备黄浆水，可缩短工艺周期、提升酸浆豆腐品质。     

离子色谱测定窖泥中4种有机酸的不确定度评定

为建立离子色谱法（IC）测定窖泥中乳酸、乙酸、丁酸和己酸4种有机酸含量不确定度的评定方法,通过参考JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和CNAS-GL06—2006《化学分析中不确定度的评估指南》中基本流程,建立模型、量化分量、合成标准不 确定度,得到乳酸、乙酸、丁酸和己酸4种有机酸的扩展不确定度,分别为42 mg/100 g、32 mg/100 g、16 mg/100 g、42 mg/100 g。 影响乳酸 和己酸不确定度的主要因素是重复性和水分含量,而影响乙酸和丁酸不确定度的主要因素是重复性、水分含量和标准曲线。 该研究 结果为窖泥中有机酸的进一步研究提供基础技术支撑。     

窖泥高产己酸菌的分离筛选及发酵性能测试

通过对老窖泥的多次富集培养,从中筛选高产己酸的菌株,并通过形态观察及分子生物学技术对其进行鉴定。同时,选取己酸产量最高的菌株进行发酵性能的测定。结果表明,从3#老窖泥中筛选并鉴定得到3株高产己酸的克鲁维氏梭菌（Clostridium kluyveri）A-1、A-3、A-5,己酸产量分别为5.73 g/L、9.77 g/L、7.45 g/L。其中Clostridium kluyveri A-3的己酸产量最高,生长周期为88.5 h,其产己酸的最佳初始pH值为7.0,发酵时间为14 d,发酵温度为37 ℃,乙醇含量为2%。pH耐受范围为3.0～11.0,温度耐受范围为13～55 ℃,乙醇最高耐受含量为5%。