超高效液相色谱-串联质谱法快速检测麦类中典型链格孢霉毒素

建立一种超高效液相色谱-串联质谱结合分散液-液微萃取前处理方法测定麦类中7 种链格孢霉毒素（链格孢酚、交链格孢酚单甲醚、交链孢烯、细交链格孢菌酮酸、交链孢毒素I、腾毒素、细格菌素）的方法。样品经3 mL一级水、10 mL 1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1,v/v）溶液提取,2 g无水MgSO4脱水和1 g NaCl盐析,振荡15 min、离心10 min后取1 mL上清液和100 μL三氯甲烷用于分散液-液微萃取。7 种链格孢霉毒素使用BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）进行分离,采用电喷雾正负离子的多反应离子监测模式。结果表明：7 种链格孢霉毒素在5 min内完成色谱分离分析,在0.5～100 μg/L质量浓度范围内均呈现良好线性关系,R2＞0.987 277,检出限为0.11～0.16 μg/kg,定量限为0.42～0.49 μg/kg;以小麦为样品基质,在3 个不同加标水平下,7 种链格孢霉毒素回收率在70.7%～101.3%之间,相对标准偏差为1.22%～4.11%。将该方法用于分析实际麦类样品（黑麦、荞麦、莜麦、青稞、燕麦、小麦）中7 种链格孢霉毒素的污染状况,结果发现腾毒素和细交链格孢菌酮酸是6 种麦类中都检出的毒素,含量分别为0.6～10.7 μg/kg和未检出～31 μg/kg;细格菌素虽检出率低于腾毒素和细交链格孢菌酮酸,但最高含量37.3 μg/kg与细交链格孢菌酮酸相当。本方法稳定、准确、灵敏、快速,能够满足麦类样品中7 种链格孢霉毒素残留分析的需求。     

臭氧处理对交链孢菌生长及其毒素积累的抑制作用

交链孢菌（Alternaria spp.）易侵染农作物,引起农产品病害,而且能够代谢产生交链孢毒素,包括细交链孢酮酸（tenuazonic acid,TeA）、交链孢酚（alternariol,AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether,AME）等,严重影响人体健康。因此,亟需高效、安全的方法用以防控交链孢菌及其毒素积累。本实验研究了臭氧处理对体外互隔交链孢（A. alternata）生长及其产毒能力的影响。结果表明,臭氧处理组的菌落直径显著低于对照组（P＜0.05）,且臭氧处理可显著抑制互隔交链孢产生TeA、AOH、AME这3 种交链孢毒素;利用扫描电子显微镜观察臭氧处理后互隔交链孢的微观形态,发现孢子和菌丝发生了凹陷、褶皱、断裂等异常现象;臭氧处理后的交链孢菌对番茄果实的致病力明显减弱,同时交链孢菌的产毒能力明显降低,20 mg/L臭氧处理条件下TeA、AOH、AME含量比对照组分别减少了36.1%、89.9%、93.2%。此外,臭氧对TeA、AOH、AME具有降解作用,降解率随着臭氧质量浓度的增加和处理时间的延长而显著提高,TeA经过20 mg/L臭氧处理30 min即可被完全降解,AOH及AME经20 mg/L臭氧处理120 min后降解率可达90%以上。综上,臭氧处理可以作为农产品及其制品中互隔交链孢及其毒素污染的防治手段。     

酵母甘露聚糖处理对番茄果实贮藏效果的影响

为了研究酵母甘露聚糖对番茄果实贮藏效果的影响,利用不同质量浓度（0、1.0、10.0 g/L）酵母甘露聚糖溶液对番茄果实进行负压渗透处理,测定贮藏过程中果实硬度、可溶性固形物含量、色差、转色指数、乙烯释放速率、呼吸强度、β-半乳糖苷酶活性及损伤接种链格孢菌等指标。结果表明：酵母甘露聚糖能够延缓番茄果实硬度的下降,减缓可溶性固形物含量的变化,降低乙烯释放速率和呼吸强度,推迟果实转色,从而有效地延缓了番茄果实后熟进程,提高了贮藏效果。其中,1.0 g/L酵母甘露聚糖作用效果最为显著。进一步测定表明,酵母甘露聚糖处理可抑制番茄果实β-半乳糖苷酶活性变化。损伤接种链格孢菌实验表明,酵母甘露聚糖还能有效地抑制由链格孢菌引起的番茄果实黑霉病,减小病斑面积,降低病害发病率。     

植物乳杆菌LNL2-4-2对互隔交链孢霉的抑制作用

互隔交链孢霉是导致果蔬采后黑斑病的主要病原体。本文采用菌饼法从发酵蔬菜来源的乳酸菌中筛选对互隔交链孢霉有拮抗作用的菌株,利用生理生化及16S rDNA测序鉴定乳酸菌。并进一步观察霉菌孢子超微结构的变化,通过测定霉菌孢子的电导率、丙二醛、可溶性蛋白质及可溶性糖含量的变化,初步探究乳酸菌对互隔交链孢霉的抑制机理。结果表明:植物乳杆菌LNL2-4-2对互隔交链孢霉的抑制率为80.86%,作用最强。采用109 CFU/mL的植物乳杆菌LNL2-4-2菌悬液处理互隔交链孢霉孢子8 h后,其细胞膜完整性降低10.98%,胞外丙二醛、可溶性蛋白质、可溶性糖含量分别增加10.66%,3.10%,11.21%。超微结构分析表明:菌株LNL2-4-2导致互隔交链孢霉的孢子表面皱缩,边缘模糊,顶端破裂,内容物泄漏。在苹果生物防治研究中,贮藏6 d时,浓度为103 CFU/mL的植物乳杆菌LNL2-4-2对互隔交链孢霉造成损伤的抑制率达47.24%。结论:植物乳杆菌LNL2-4-2可作为针对果蔬采后传统杀菌剂的新型替代品。     

人工接种温州蜜柑后链格孢霉毒素的产生及分布规律

采用超高效液相色谱-串联质谱法结合Qu ECh ERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)前处理方法,研究温州蜜柑人工接种链格孢菌(Alternaria alternate)后,病斑部位全果、非病斑部位果皮和果肉中腾毒素(tentoxin,Ten)、链格孢酚(alternariol,AOH)、交链格孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交链孢烯(altenuene,ALT)和细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid,Te A)5种链格孢霉毒素的产生和分布规律。结果表明,病斑部位全果、非病斑部位果皮和果肉中的链格孢霉毒素含量随着病斑直径的扩大,不同链格孢霉毒素的变化趋势不同。Te A、Ten、AME和AOH在所有部位中均有检出,其中Te A检出含量最高,在病斑部位的含量范围为3.05×10~3~55.88×10~3μg/kg,在非病斑部位的含量范围为65.35~40.68×10~3μg/kg;Ten、AME和AOH在病斑部位的含量范围分别为69.16~373.94、22.63~1 395.82μg/kg和8.18~689.19μg/kg;非病斑部位的含量范围分别为0~67.56、0~195.96μg/kg和0~301.91μg/kg;ALT在非病斑部位果肉中未检出,但在非病斑部位的果皮和病斑部位的全果中均有检出,含量最高达16.61μg/kg。研究表明,由于柑橘感染链格孢菌后产生的毒素会从发病部位扩散到健康部位累积,因此,在鲜食加工和风险评估中应引起关注和重视。     

纳他霉素对葡萄采后交链孢菌的抑制作用

交链孢菌(Alternaria sp.)是导致鲜食葡萄采后腐烂变质的主要病原菌。以葡萄采后交链孢菌为病原菌,采用生长速率法、悬滴法及活体接种法,研究了不同浓度纳他霉素抑菌液对菌丝生长、孢子萌发的抑制作用以及对果实的防病效果。结果表明,适宜浓度的纳他霉素对葡萄采后交链孢菌的抑制效果明显,对菌丝生长及孢子萌发的抑菌中浓度(EC50)分别为83.48和89.47mg/L;当抑菌液浓度达200mg/L时,对菌丝生长和孢子萌发的抑制率均达到80%以上。活体接种实验结果表明,浓度为200mg/L的纳他霉素抑菌液可显著(p<0.05)抑制葡萄采后交链孢菌引起的霉烂变质。综上,纳他霉素处理对葡萄采后交链孢菌具有较好的抑制活性,可作为葡萄采后绿色保鲜剂的潜在资源。     

光照对交链孢毒素合成的调控

目的 明确光调控交链孢（Alternaria）产真菌毒素的作用。方法 在光/暗培养条件下,比较分析光照对2种交链孢菌株（ATCC 66981和Pear-3）的菌丝生长、孢子形成以及毒素合成的影响。结果 持续白光照射对交链孢菌丝生长影响不显著,而显著抑制其孢子形成。光照刺激交链孢菌ATCC 66981中交链孢酚（alternariol, AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether, AME）和腾毒素（tentoxin, TEN）3种毒素的产生。菌株持续光照培养30天,AOH、AME和TEN毒素浓度分别为120、182和173 g/L;较之黑暗培养,分别增加了1.1、5.9和9.6倍。光照抑制交链孢菌Pear-3中细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid, TeA）毒素的合成。菌株光照培养6天,TeA毒素浓度即已达142 g/L;而黑暗培养甚至高达325 g/L,毒素产率反而增加了1.3倍。结论 光照不影响交链孢菌丝生长,而对孢子形成影响显著;持续白光照射能够促进交链孢中AOH、AME和TEN毒素的产生,而抑制TeA毒素的产生。     

银杏外种皮提取物对苹果链格孢霉的抑制作用

为研究银杏外种皮提取物（Ginkgo biloba exocarp extract,GBEE）对苹果链格孢霉的抑制作用,采用乙醇提取法和水提取法提取银杏外种皮活性成分,并采用菌丝生长速率法,测定银杏外种皮提取物对苹果链格孢霉的抑制效果,研究银杏外种皮乙醇提取物对苹果链格孢霉孢子萌发和芽管伸长的影响。通过测定电导率,蛋白质、核酸的渗漏量,细胞膜损伤程度以及抗性相关酶活性来进一步研究抑制行为。GBEE的抑菌作用呈浓度依赖性,水溶性提取物于1 200 mg/L抑菌率达到16.94%,乙醇提取物于1 200 mg/L抑菌率达到61.39%,约为水溶性提取物的3.6倍。银杏外种皮乙醇提取物使苹果链格孢霉菌体细胞膜通透性增加,膜脂过氧化程度加剧,丙二醛（malondialdehyde,MDA）和H2O2含量升高,胞内核酸、蛋白质外泄,抑制抗性相关酶活性,通过光学显微镜观察到乙醇提取物处理组的链格孢霉菌无细胞壁间隔。乙醇提取物的抑菌效果比水提物好,通过破坏苹果链格孢霉菌的细胞膜完整性和抑制抗性相关酶活性来达到抑菌目的。     

继代培养对链格孢菌生长及产毒的影响

目的 探究连续继代培养对链格孢菌(Alternaria alternata)菌株的生长以及产毒的影响。方法 将10株链格孢菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA)上连续继代培养,分析菌株的生长、产孢情况;利用超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)检测并分析主要链格孢霉毒素[包括交链孢酚(alternariol,AOH)、交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)、交链孢烯(altenuene, ALT)、细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)]的含量变化。结果 在PDA培养基中,连续继代培养链格孢菌极易出现角变、菌丝变白、菌丝生长速率加快等菌株退化现象。随着继代培养次数的增加,菌株生长速度加快,菌落直径变大,角变率增大;10株链格孢菌中有7株(MY-4、MY-12、MY-15、MY-73、MY-80、MY-103、MY-117)产孢量随着继代次...     

蓝莓贮藏期病原菌的分离鉴定及植物粗提物抑菌效果研究

以湖南省长沙县的兔眼蓝莓(粉蓝)为试材,分离并鉴定出自然贮藏过程中引发蓝莓果实腐烂变质的3株主要病原真菌(LM-1、LM-2和LM-3),同时采用牛津杯法开展21种植物乙醇粗提物对其中2株低温贮藏中重要致病真菌的抑菌活性筛选,并确定其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。经形态学观察和18S r DNA序列分析将3株病原真菌分别鉴定为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、互隔交链孢霉(Alternaria alternata)和类阿达青霉(Penicillium adametzioides)。抑菌实验结果表明,丁香对灰葡萄孢菌和互隔交链孢霉的抑制能力最强,0.5 g/m L丁香提取液对灰葡萄孢菌和互隔交链孢霉的平均抑菌圈直径分别达47.55、40.66 mm,MIC分别为15.63、31.25 mg/m L,MBC分别为31.25、62.5 mg/m L。     

碳酸铵对柑橘酸腐病菌的抑制效果及作用机制

由酸腐病菌引起的酸腐病是柑橘重要的采后病害,目前缺少有效控制酸腐病的杀菌剂。本研究分析了碳酸铵作为通常认为安全的药剂对酸腐病菌的抑菌活性和可能的作用机制。结果显示：碳酸铵可以抑制孢子萌发和芽管伸长,抑制菌丝生长,并且抑制效应与质量浓度呈正相关,在0.8 g/L条件下完全抑制孢子萌发和菌丝生长。进一步分析表明,碳酸铵抑制孢子活性,高效抑制菌丝呼吸,并改变膜通透性,增加离子渗出率,加剧核酸和蛋白的丢失,进而导致菌丝细胞功能丧失。活体实验结果表明,夏橙接种孢子浓度为1×106 个/mL 的20 μL酸腐病菌孢子悬浮液,经20 g/L碳酸铵处理可显著降低其病斑直径,减轻果实发病。结论：碳酸铵可作为杀菌剂的替代方法控制柑橘果实的酸腐。     

吡啶-2,6-二羧酸处理对梨果采后黑斑病控制作用及其抑菌机理

由互隔交链孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病是梨果主要采后病害之一,会导致严重的经济损失。本实验以梨果黑斑病菌A. alternata为研究对象,通过体内外实验研究了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）代谢产物吡啶-2,6-二羧酸（pyridine-2,6-dipicolinic acid,DPA）对A. alternata生长的抑制和对梨果黑斑病的控制作用,并进一步探讨了其抑菌作用的机理。结果表明：DPA能显著抑制A. alternata的菌落生长、孢子萌发以及芽管伸长,其中2.0 mmol/L DPA处理后培养9 d时A. alternata菌落直径仅为对照组的51.76%,4.0 mmol/L处理可完全抑制A. alternata的生长。DPA处理对梨果黑斑病的扩展有明显的控制作用,贮存至第11天时,20.0 mmol/L DPA处理组早酥梨病斑直径仅为对照组的55.17%。进一步研究表明,DPA处理提高了A. alternata细胞膜的通透性,菌丝电导率、蛋白质和核酸渗漏量显著增加,同时DPA处理降低了细胞膜组分麦角甾醇质量浓度,提高了A. alternata丙二醛浓度。结论：DPA可通过延缓A. alternata生长、提高膜通透性、破坏细胞膜的完整性和促使膜脂氧化而发挥抑菌作用。     

烟草叶围细菌的分离及其对Alternaria alternata的拮抗作用

分离到烟草叶围细菌136株,通过对峙培养实验筛选出对烟草赤星病菌A.alternata有较强拮抗活性的9个菌株.离体叶片生防测定实验表明,9株细菌均能不同程度地减轻烟草赤星病的发生.其中菌株Tpb88具有较强和稳定的拮抗作用,无菌滤液实验表明,叶围细菌Tpb88在一定浓度范围内能有效抑制A.alternata菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长,且浓度越高,抑制能力越强,结果表明Tpb88对烟草赤星病菌的拮抗机制可能为抗菌物质的产生.     

ε-聚赖氨酸对樱桃采后病原菌橘青霉和链格孢菌的抑菌作用研究

目的 探究ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)对樱桃果实采后病原菌橘青霉(Penicillium citrinum)和链格孢菌(Alternaria alternata)的抑菌作用和抑菌机制.方法 本研究测定100、200、400、800 mg/Lε-PL处理对2种病原菌菌丝生长、孢子萌发、细胞膜透性的影...     

采后亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的控制及贮藏品质的影响

通过离体和体内实验研究亚硒酸钠对杏果黑斑病菌互隔交链孢（Alternaria alternata）的抑制作用及黑斑病的控制效果和贮藏品质的影响。结果表明,亚硒酸钠处理能显著抑制A. alternata菌落的生长和孢子萌发,且存在质量浓度效应,40 mg/L的亚硒酸钠能显著抑制A. alternata菌落的生长,其菌落直径较对照降低了30.8%,同时亚硒酸钠还能使A. alternata菌丝发生凹陷、扭曲等形态结构的改变;体内实验表明,采后亚硒酸钠处理能有效抑制损伤接种A. alternata的杏果黑斑病的扩展,其中20 mg/L亚硒酸钠的控制效果最佳,其病斑直径较对照减小了11%;采后亚硒酸钠处理还能够明显减少杏果乙烯的释放和呼吸强度的升高,延缓质量损失率和硬度的降低。可见硒在果蔬采后防腐保鲜中具有潜在的应用前景。     

气体二氧化氯对葡萄杀菌效果及品质的影响

以‘巨峰’葡萄为试材,从其表面分离优势菌并鉴定其为大肠杆菌与考克氏菌,利用NaClO₂与干冰间接反应开发一种气体二氧化氯(ClO₂)处理方法以灭活葡萄表面优势菌,通过测定菌落总数对数值减少量评估气体ClO₂对葡萄的杀菌效果,同时通过测定4℃贮藏30 d期间葡萄样品的色泽参数、果实硬度、质量损失率以及可溶性固形物含量评估气体ClO₂对葡萄品质的影响。结果表明,气体ClO₂处理对接种于葡萄表面的大肠杆菌与考克氏菌具有良好杀灭效果。当ClO₂累积浓度从131μL/(L·h)提升至599μL/(L·h),大肠杆菌菌落总数对数值减少量从1.6(lg(CFU/g))升至3.5(lg(CFU/g)),考克氏菌菌落总数对数值减少量从1.0(lg(CFU/g))升至4.5(lg(CFU/g))。与对照组(S0)相比,经ClO₂处理后贮藏30 d期间葡萄色泽并没有明显变化,与S0和低累积浓度处理组(S1)相比,高累积浓度处理组(S2)在4℃贮藏30 d后...     

香芹酚处理对枸杞鲜果采后黑霉病的控制

为探究香芹酚处理对宁夏枸杞鲜果采后黑霉病的控制,在离体条件下研究了香芹酚对宁夏枸杞鲜果采后黑霉病菌(Alternaria alternata)生长、菌落形态及其超微结构的影响,并在活体条件下研究了其对枸杞黑霉病的控制效果以及对果实过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响。离体试验结果表明:香芹酚处理能显著抑制A. alternata的孢子萌发和菌丝生长,其抑制效果存在浓度依赖效应;与对照相比,浓度为8 μL/L香芹酚对菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别达到80.81%和57.17%;扫描电镜观察发现香芹酚处理的A. alternata菌丝量少,表面粗糙,粗细不均匀,部分出现塌陷,孢子细胞受到不同程度的破坏。进一步体内试验结果表明:香芹酚处理枸杞果实能抑制损伤接种黑霉病的发病率和病斑扩展速度,并且处理还能提高果实的POD和PAL活性。由此可见,香芹酚可以通过直接治愈和间接诱导抗性来控制枸杞鲜果采后黑霉病,在采后病害控制中具有潜在的应用前景。     

链格孢侵染对枸杞鲜果挥发性物质释放的影响

目的 探究链格孢(Alternaria alternata)侵染对枸杞果实挥发性化合物释放的影响。方法 以宁杞1号枸杞果实为研究对象,通过损伤接种链格孢菌处理,分析测定接种后果实发病率和病斑面积,采用顶空气相离子迁移谱探究接种对果实挥发性成分释放的影响。结果 接种果实发病率和病斑直径均随贮藏时间延长显著增加,5-甲基-2-呋喃甲醇可作为区别损伤和非损伤处理的候选物质,损伤接种链格孢菌处理显著促进了第5 d果实中2,3-二甲基吡嗪、2-正戊基呋喃和二异丁基酮等物质和第1 d后果实中苄醇、2-丁酮、异戊酸乙酯、3-甲硫基丙醛和庚醛等物质的释放,这些物质可能与枸杞黑霉病的发生和严重度有关,可作为鉴定链格孢侵染枸杞果实的候选靶标物质,通过指纹图谱和主成分分析将不同处理枸杞样品的挥发性成分进行有效区分。结论 链格孢侵染可促进枸杞果实香气成分释放,为枸杞黑霉病快速诊断与评估奠定基础。     

Production of alternariol and alternariol methyl ether by Alternaria alternata grown on fruits at various temperatures

Two toxigenic strains of the fungus Alternaria alternata (ATCC 56836 and ATCC 66868) were grown on surface-disinfected, fresh, ripe fruits and tested for the production of alternariol (AOH) and alternariol methyl ether (AME). Examined fruits included strawberries; red and green seedless grapes; concord grapes; red delicious, golden delicious, and gala apples; and blueberries. After inoculation, fruits were incubated at 4, 10 degrees C, or room temperature (approximately 21 degrees C) for up to 3 weeks. At weekly intervals, duplicate samples were analyzed for AOH and AME by using liquid chromatography. Results indicated that A. alternata and its metabolites were not a major problem in strawberries due to the presence of fast-growing molds like Rhizopus and Botrytis that outgrew and possibly inhibited Alternaria. Both Alternaria strains showed limited growth on apples, although fast-growing molds were not present after surface disinfection; AOH and AME were produced only by the ATCC 56836 strain on the golden delicious and gala varieties, (ranging from <0.1 to 5 microg/g and <0.1 to 14 microg/g for AOH and AME, respectively). Restricted growth of both strains without toxin production occurred in blueberries, whereas moderate growth and AOH (<0.1 to 3,336 microg/g) and AME (<0.1 to 1,716 microg/g) production took place in grapes.     

山梨酸盐与钙胁迫对甜樱桃灰霉病抗性的诱导作用

以‘秦樱1号’樱桃为试材,研究不同质量浓度山梨酸钾（1、3、5、7 g/L）、CaCl2（5、10、15、 20 g/L）处理对离体灰霉菌的抑制效果,通过菌丝生长抑制率、扫描电子显微镜观察芽管生长及孢子萌发抑制率 筛选出最佳处理质量浓度。结果表明：与对照组相比,山梨酸钾、CaCl2处理均能不同程度地抑制灰霉菌菌丝的生 长,抑制灰霉菌芽管的伸长,降低孢子的萌发率,抑制效果随质量浓度的升高逐渐加强,20 g/L CaCl2、5 g/L山梨 酸钾处理抑制效果最好。以无菌水为对照,用采前喷20 g/L CaCl2、采后5 g/L山梨酸钾处理及二者复合处理接种灰 霉菌的甜樱桃,在（23±1）℃下存放5 d,通过测定发病率、病斑直径及相关酶活力探究不同处理对甜樱桃灰霉病 的抑制效果。在活体接种实验中,与对照组相比,20 g/L CaCl2、5 g/L山梨酸钾单独及复合处理均能有效抑制接种 到甜樱桃果实上灰霉菌的生长,减缓病斑的扩展,CaCl2与山梨酸钾处理能显著抑制樱桃果实中MDA含量上升,诱 导果实合成与积累抗性相关酶（多酚氧化酶、过氧化物酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶）在接种1 d后或接种3 d后的 活力提高,以5 g/L山梨酸钾与20 g/L CaCl2复合处理抑制效果最好,该研究为降低由灰霉菌侵染引起的病害及采后 甜樱桃果实防腐保鲜提供了参考。