CD59活性位点相关性基因突变的构建与表达

构建了野生型和突变型CD59重组质粒,建立了高效真核表达系统,探讨了W40位点的生物学活性。采用基因点突变技术使CD59W40基因位置缺失（突变1,M1）及C39W40K41→W39W40W41（突变2,M2）,重叠延伸PCR（overlap extension PCR）定点诱变扩增突变基因,重组入真核表达质粒pIRES,利用阳离子脂质体（Lipfectamine2000）将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）进行表达。酶切鉴定及序列测定证实成功构建了pIRES-MICD59、pIRES—M2CD59和pIRES-WTCD59,突变基因约500bp。G418筛选出了CHO转染细胞的稳定细胞克隆,免疫荧光、ELISA检测筛选MICD59、M2CD59和WTCD59蛋白高表达株,连续传代30代有高表达;补体溶细胞反应显示与野生型CD59相比,突变型M1CD59失去对补体的抑制功能,而M2CD59抗补体活性略增高。证实CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤治疗。     

人膜补体调节蛋白MCP、CD59在稳定转染的细胞中的共表达及功能研究

采取内核糖体进入位点(IRES)策略构建含人的膜补体调节蛋白基因MCP和CD59的cDNA的双顺反子真核表达载体pcDNA3-MCPIRESCD59,以磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,用 G418筛选阳性克隆,并研究MCP和CD59双基因在稳定细胞系中的共表达及保护功能.PCR实验结果显示双基因稳定整合在异源细胞NIH3T3的染色体上,RT-PCR及Western印迹实验分别从 RNA水平和蛋白质水平证实了人补体调节蛋白分子MCP和CD59在细胞系中皆获得同步表达.检测连续传代30次的NIH3T3 pcDNA3-MCPIRESCD59,结果表明人MCP和CD59基因仍稳定整合在细胞基因组中,并未随着传代而丢失,为稳定的转双基因细胞系.补体依赖的细胞毒反应表明,pcDNA3-MCPIRESCD59转染细胞由于MCP和CD59的共表达获得了高于MCP或CD59单一表达时所提供的保护功效,能更好地抑制人补体依赖的细胞毒作用的发生,保护宿主细胞免受人补体的攻击.以上结果表明,所构建的双基因重组表达载体实现了不同人补体调节蛋白基因高效转移和高水平共表达,在克服超急性排斥反应的基因治疗中有潜在的应用价值.     

胸腺素α1基因在钝顶螺旋藻中的表达

将钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）在24℃培养，并经2mmol/L EDTA预处理16－24h，以本实验室构建的基因整合平台系统供体质粒pEUTISI进行超声波转化螺旋藻，经筛选获得了具G418抗性的转化藻株。通过PCR扩增和Southern杂交证实，pEUTISI中目的的基因UB－Tα1和nptII基因已整合到钝顶螺旋藻染色体上。转化藻株经45℃热诱导40min后，进行蛋白质SDS－PAGE电泳和Western blot，杂交结果证实，外源胸腺素α1基因在螺旋藻中得到有效表达。     

小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4 、CD8 T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.     

乙肝表面抗原S2S基因在蓝藻Synechococcus sp.PCC7942中的表达研究

用PCR法将乙肝表面抗原基因S2S片段从乙肝病毒中扩增得到,将其插入到蓝藻热休克表达载体pEUTMT1中,构建成表达重组质粒pES2ST1.将蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的总染色体与质粒pES2ST1同时进行EcoRI和SacI双酶切,再连接构建成为系列含有蓝藻染色体DNA同源片段的供体表达质粒.经转化筛选得到蓝藻Synechococcus sp.PCC7942转化藻株.PCR和Southern 杂交证明目的基因已经整合到宿主的染色体中.转化藻通过热诱导后,Northern-blot结果呈阳性,用化学发光检测技术可以检测到微量目的蛋白的表达,检测含量约为0.78～0.64ng/ml,目的蛋白约为可溶性蛋白的1.1×10-6～1.5×10-6.     

螺旋藻多糖抗HSV-1作用的体外实验研究

报道从钝顶螺旋藻中提取的一种水溶性多糖类化合物，即钝顶螺旋藻多糖（PSP），在培养细胞内抗单纯疱疹病毒1型（HSV－1）作用的研究。以不同剂量的PSP作用于病毒复制周期的各个阶段，以病毒半数感染量（TCID50），细胞病变（CPE），蚀斑形成（PFU），MTT染色细胞保护率（MTT法）及核酸分子杂交作为评价指标，判断药效。结果表明：PSP对Vero细胞毒性极低；对HSV－1无直接灭活作用，可干扰病毒向宿主细胞吸附，且经PSP预处理的细胞，能明显阻滞病毒产生细胞病变；PSP可有效地抑制病毒复制，但不影响病毒的释放；PSP可明显抑制HSV－1糖蛋白gG mRNA的表达。提示PSP抗病毒靶位在于阻断病毒吸附和抑制感染细胞内病毒的复制及抑制HSV－1糖蛋白gG基因的转录。     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

针对我国口蹄疫(FMD)流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT.该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV 2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因(其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株)作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因.将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒(FPV)表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带OAAT表达金和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDV VP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础.     

共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素(AIV HA)基因串联后(拥有同一个阅读框)和鸡白细胞介素-18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子1(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

来源于芽孢杆菌(Bacillus circulans)的乳糖酶在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子选择偏好对来源于芽孢杆菌(Bacillus circulans)的乳糖酶基因lacO进行了分子改造.改造后的基因lacM按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上,构建得到重组毕赤酵母表达质粒.PCR检测、SDS-PAGE电泳分析和酶活力测定的结果表明,lacM基因已重组到酵母染色体上,并能正常分泌表达.与未改造的基因lacO的毕赤酵母重组子相比,酶蛋白表达量明显增加,约为改造前的3倍以上.     

共表达VP3与hIL-18基因真核重组质粒的构建及对人结肠癌细胞的影响

先将鸡贫血病毒VP3基因插入真核表达载体pVAXl的多克隆位点，再将pVAX1载体上的IRES启动子及新霉素基因一同切下插入pVAXl的VP3基因下游，然后切下新霉素基因，将pIRES1基因插入其中，构建成pVVP3IL-18，将pVVP3IL-18转染Heda细胞。间接免疫荧光表明，在细胞膜和细胞浆观察到了特异的黄绿色荧光，证明表达了hIL-18。pVVP3IL-18转染人结肠癌细胞HCY-116后，经AO／EB染色及电镜观察，可见大量细胞凋亡。说明真核重组质粒pVVP3IL-18可在HeLa细胞中表达，并可在体外诱导人结肠癌细胞HCT-116凋亡。     

嵌合抗CD20抗体分子在CHO细胞中的表达

利用PCR方法从抗CD20抗体Fab′片段的表达载体上扩增抗CD20抗体的轻链和重链可变区，将轻链和重链可变区组装到含有人抗体恒定区的表达载体中，构建抗CD20抗体IgG的轻链和重链表达载体PK100VL和PGL05VH，并用质脂体法共转染CHO细胞，RT－PCR和ELISA检测结果证实了抗CD20抗体IgG全分子在CHO细胞中的分泌表达。免疫结合结果表明CHO细胞分泌表达的抗CD20抗体IgG全分子可与CD20阳性的B淋巴瘤Raji细胞结合。     

导入四碳二羧酸转移酶基因对费氏中华根瘤菌共和固氮效率的影响

将来自苜蓿中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）的四碳二羧酸转移酶基因（ｄｃｔＡＢＤ）经ｐＩＪ２９２５克隆到广宿主、稳定性质粒ｐＴＲ１０２上,获得诱导型表达的重组质粒ｐＨＮ２０２。在此基础上再引入来自ｐＤＢ３０所含的发光酶基因（ｌｕｘＡＢ）作分子标记,以ｐＴＲ１０２为基础建成带有ｄｃｔＡＢＤ和ｌｕｘＡＢ的重组质粒ｐＨＮ２０５。＃? ｄｇ ｕｓ ｓｇ ｒｕｖ ｗｇｋ ｌｆｔｑ,ｕ     

精子干细胞转染法制备转基因兔的研究

采用直接注射的方法 ,将脂质体包裹的含人乳铁蛋白基因重组质粒 pLNCXHLF注入兔睾丸组织中 ,一个月后与正常雌兔交配。所产仔兔经PCR、Southern检测证明获得了转基因兔 ,转基因阳性率平均为 35 %。实验结果表明 ,通过注射可将外源基因导入到曲细精管中 ,进而完成对精子干细胞的转染 ,获得携带外源基因的成熟精子 ,受精后可得到转基因动物。该方法是一种简捷、有效的新途径 ,既节省时间又降低了成本 ,为利用精子载体制备转基因动物的研究提供了很有价值的参考。     

乙肝病毒融合表面抗原SA—28基因在酵母中的表达

利用基因工程技术，先将乙肝病毒表面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８置于酵母杂合启动子ＡＤＨ２－ＳＵＣ２的控制下，然后将ＳＡ－２８基因的表达单元插入高稳定质粒ｐＨＣｌ１的ＢａｍＨＩ位点，构建成表达质粒ＹＦＤ１５０和ＹＦＤ１５０－ｏ并将其转化酿酒酵母Ｙ１９。对转化子表达ＳＡ－２８基因的研究表明：表达受葡萄糖浓度调控；表达产物具有Ｓ和ｐｒｅＳ１双重抗原性，并形成密度为１．２０－１．２２ｇ／ｍｌ的颗粒     

HIV-1核心蛋白Gag与IL-6共表达重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性研究

分别将IL-6和HIV-1gag基因插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTAL串联启动子和复合启动子(ATI-P7．5)下游，构建了重组鸡痘病毒表达质粒pUTA-GAG-IL6。经同源重组和Western blot检测，获得重组鸡痘病毒，并将该重组病毒免疫BALB／c小鼠，检测免疫小鼠血清抗体水平和特异性CTL杀伤活性。结果获得的重组鸡痘病毒可同时表达HIV-1核心蛋白和IL-6，并在感染细胞内形成病毒样粒子。重组病毒具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。     

纳米金的制备及在化妆品中的应用初探

采用柠檬酸钠还原氯金酸制备纳米金,利用X射线荧光能谱和透射电子显微镜对产品进行了表征,通过纳米金溶胶及溶胶中含有的柠檬酸钠和保护剂PVP对Hela细胞、CHO细胞的MTT试验,研究了纳米金溶胶及纳米金颗粒对细胞的毒性,结果表明,纳米金溶胶和纳米金颗粒对这两种细胞均没有产生毒性。将纳米金加入到化妆品基础配方中制备得到了稳定的乳状液,为纳米金用于高级化妆品可行性提供部分实验依据。