脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应和机理

研究脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应和机理,为脂肽协同茶多酚应用于副溶血弧菌的控制提供理论依据。利用"棋盘法"研究脂肽和茶多酚对副溶血弧菌的协同抑菌效应;通过研究脂肽和茶多酚独立作用及协同作用对细胞膜完整性、细胞蛋白质合成及磷代谢方面影响来研究二者的协同抑菌机理。结果表明:脂肽和茶多酚对副溶血弧菌存在强烈的协同抑菌效应,部分抑菌浓度指数达到0.19;与1/16最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)脂肽或1/8 MIC茶多酚各自独立作用相比,在1/16 MIC脂肽和1/8 MIC茶多酚协同作用下,副溶血弧菌的细胞膜通透性显著增强,细胞部分蛋白质合成的抑制作用得到进一步加强,并且细胞的磷代谢完全受到抑制。结果表明,脂肽和茶多酚对副溶血弧菌具有强烈的协同抑菌效应,其协同抑菌作用主要通过二者协同破坏细胞膜的完整性,从而影响细胞部分蛋白质的合成与正常代谢实现的。     

香芹酚和月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐联用对荧光假单胞菌抑菌作用的研究

为探究香芹酚和月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐（ethyl-Nα-lauroyl-L-arginate hydrochloride,LAE）联用对荧光假单胞菌的抑菌效果与机制,通过最小抑菌浓度法（minimum inhibitory concentration,MIC）、棋盘法和生长曲线的测定研究抑菌效应;利用蛋白质和核酸泄漏、透射电子显微镜观察和胞内蛋白质电泳的方法分析抑菌机制;以生物被膜形成、群集和泳动为指标,测定群体感应活性。结果显示,香芹酚和LAE联用对荧光假单胞菌有相加抑菌作用。1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE抑菌效果最显著,24 h抑制率达97.9%。以上组合联用可使荧光假单胞菌的细胞膜通透性显著增强,蛋白质和核酸快速泄漏,1 h时OD280值和OD260值分别升高31.2倍和17.5倍;处理3 h后,菌体胞内电子密度下降,蛋白质浓度下降84.1%,且条带丰富度减弱。联合作用下,对生物膜形成、群集和泳动的抑制率分别达到97.0%、92.5%和65.0%。综上表明,香芹酚和LAE联用破坏荧光假单胞菌的细胞完整性,引起胞内物质泄漏,发挥强烈的抑菌作用。同时,二者联用表现出抑制群体感应活性的能力。     

柠檬草精油对副溶血性弧菌的抑菌活性及机制

目的:探究柠檬草精油(LG-EO)对副溶血性弧菌的抑菌活性和机理。方法:通过测定LG-EO对副溶血性弧菌的最低抑制浓度(MIC)、时间-杀灭分析、上清液中AKP活性、电导率和蛋白质泄漏量、细胞形态、膜电位、呼吸链脱氢酶活力及胞内DNA的含量和结构等,研究LG-EO对副溶血性弧菌的抑菌活性和机制。结果:LG-EO对副溶血性弧菌的MIC范围80~120 μg/mL,在80~280 μg/mL处理浓度范围,其杀灭效果随浓度和时间的增加而提高,240 μg/mL LG-EO处理10 min即可灭活全部副溶血弧菌。与高于MIC的LG-EO共培养,副溶血弧菌细胞壁、膜的完整性被破坏,导致上清液中AKP活性、蛋白质含量和电导率上升,细胞边界模糊和内容物流失。菌体细胞膜电位、呼吸链脱氢酶和ATP酶活性等显著降低。基因组DNA的核酸电泳和紫外吸收光谱提示,DNA在LG-EO作用下流失严重并与主要成分柠檬醛发生互作。结论:柠檬草精油对副溶血性弧菌有较强的抑菌作用,LG-EO通过破坏细胞壁、膜构造,干扰细胞能量代谢,造成DNA流失或变性等快速杀灭副溶血性弧菌。本研究为探明LG-EO的抑制致病性弧菌机理奠定良好的基础,在水产品加工业中具有广泛的应用潜力。     

4种防腐剂对副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用

在确定4种防腐剂壳聚糖、山梨酸钾、脱氢乙酸钠和ε-聚赖氨酸对副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的基础上,研究其对副溶血弧菌生物膜的抑制作用。采用结晶紫染色法测生物膜形成量,XTT法测生物膜代谢活性,硫酸-苯酚法测定生物膜中胞外多糖的分泌量。结果表明,壳聚糖的MIC最小,为1.25 mg/m L。4种防腐剂在MIC以及亚抑菌浓度条件下对副溶血弧菌生物膜均有明显的抑制作用,不仅抑制生物膜的形成,而且能显著降低细菌的代谢活性,减少胞外多糖的分泌,其中壳聚糖对副溶血弧菌生物膜的抑制作用最强。     

柠檬醛对副溶血性弧菌的抑制作用

有效预防和控制副溶血性弧菌对食品的污染对于保障公众健康具有重要意义。本研究首先利用琼脂稀释法测定7?种植物源活性物质（丁香酸、阿魏酸、绿原酸、硫辛酸、原儿茶酸、原儿茶醛和柠檬醛）对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度,在此基础上选择柠檬醛进行后续实验;通过检测经柠檬醛处理后的副溶血性弧菌生长曲线、细胞膜电位、胞内ATP浓度、细胞膜完整性以及细胞形态的变化,探究柠檬醛对副溶血性弧菌的抑制作用及可能的作用机理。结果表明：柠檬醛相比于其他6?种植物源活性物质对副溶血性弧菌有更好的抑菌效果,其对两株标准菌株和8?株分离菌株的最小抑菌浓度在0.10～0.60?mg/mL范围内;柠檬醛能够引起副溶血性弧菌细胞膜电位去极化、胞内ATP浓度降低及细胞膜完整性下降,同时可使细胞皱缩变形。本研究结果表明柠檬醛具有良好的抑菌功效,并有潜力作为天然的抗菌物质应用于食品工业。     

反式肉桂醛对副溶血性弧菌的抑制作用

本研究通过测定TC对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)评价其抑菌效果;随后通过测定TC对副溶血性弧菌生长曲线、生长动力模型、细胞膜完整性及细胞形态的影响探究其可能的抑菌机理;最后,构建副溶血型弧菌污染的鲜虾模型,评价TC对鲜虾中副溶血性弧菌的控制作用。结果表明,TC对副溶血性弧菌的MIC为50～70μg/mL;TC可降低副溶血性弧菌最大生长速率、延长其生长延滞期;TC可使副溶血性弧菌细胞膜完整性显著降低,并使副溶血性弧菌细胞形态干瘪、皱缩;在鲜虾模型中,体积分数0.4%的TC在1 h(4℃)使鲜虾中的副溶血性弧菌降低至检出限以下。研究结果表明,TC有潜力作为天然的抗菌物质应用于鲜虾及其他海产品中有效控制副溶血性弧菌。     

纳豆菌抗菌脂肽对副溶血弧菌的抑菌机理

目的:对纳豆菌抗菌脂肽抑制副溶血弧菌的抑菌机理进行探讨。方法:通过纳豆菌抗菌脂肽对副溶血弧菌生长曲线、细胞超微结构、细胞膜通透性、细胞DNA的作用、细胞蛋白的合成、细胞代谢的影响等方面的研究,探讨纳豆菌抗菌脂肽抑制副溶血弧菌的机理。结果:抗菌脂肽可以使副溶血弧菌细胞膜通透性增加,使得细胞内具有紫外吸收的大分子物质泄漏到细胞外;扫描电镜结果表明抗菌脂肽可以导致副溶血弧菌细胞壁破裂或形成孔洞;抗菌脂肽能够和副溶血弧菌DNA体外结合,导致DNA最大吸收峰发生了轻微的蓝移,且产生增色效应;SDS-PAGE分析表明抗菌脂肽对副溶血弧菌蛋白表达未见有明显影响;当抗菌脂肽的质量浓度达到0.6 MIC以上时,其对副溶血弧菌代谢活力的抑制作用显著。结论:纳豆菌抗菌脂肽可使副溶血弧菌的细胞膜通透性增加,或形成孔洞导致细胞内一些物质泄漏,使细胞生长受到抑制,进而导致死亡。     

酚酸对水产品腐败希瓦氏菌的抑菌作用

比较了没食子酸、原儿茶酸和绿原酸3种酚酸对腐败希瓦氏菌的抑制活性,并通过扫描电镜、流式细胞仪、细胞膜完整性和通透性测定等探讨了没食子酸对腐败希瓦氏菌的抑菌作用。结果表明:3种酚酸中没食子酸对腐败希瓦氏菌的抑制活性最强,其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为1.25,2.50mg/mL。经最小抑菌浓度没食子酸处理后,腐败希瓦氏菌细胞形态改变,表面有明显凹陷;细胞凋亡率明显增高;核酸和蛋白泄漏增加,细胞膜完整性遭到破坏;细胞膜通透性增加,胞内电解质大量泄漏至培养液中。     

香辛料提取物对副溶血弧菌生物膜的抑制作用

对大蒜、肉桂等6种天然的香辛料分别采用水和80%乙醇进行提取并筛选出对副溶血弧菌抑菌能力较强的提取物,探究这些香辛料提取物对副溶血弧菌生物膜的抑制作用。研究结果表明大蒜、肉桂、丁香具有较强的抗菌作用,而花椒、小茴香、迷迭香则相对较弱。肉桂和大蒜的乙醇提取物对副溶血弧菌的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)皆为6.25 mg/m L。亚抑菌浓度的提取物除了能够抑制副溶血弧菌生物膜的形成,还能抑制生物膜内细菌的代谢活性,减少细菌胞外多糖的分泌。激光共聚焦扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)观察发现,处理后死细胞的数量明显增多,且生物膜内多糖的含量明显变少。     

茶皂素对食源性腐败酵母的抑菌能力及作用机理

该研究通过测定抑菌圈直径、最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）,评价茶皂素对酿酒酵母、鲁氏接合酵母及白色假丝酵母三种食源性腐败酵母的抑菌能力,并筛选出机理研究指示菌;进而通过考察时间-杀菌曲线、生物膜抑制率、菌体细胞形态、细胞膜通透性、细胞膜完整性、遗传物质以及蛋白泄露和胞内总蛋白等指标,阐述茶皂素抑菌机理。抑菌能力试验结果显示茶皂素对三种腐败酵母均有抑菌作用,其中酿酒酵母抑菌直径为16.00 mm,MIC和MBC分别为0.05、0.10 mg/mL,抑菌效果最为显著。以酿酒酵母为指示菌的抑菌机理研究结果表明：茶皂素可使菌体直接进入衰竭期;可显著抑制生物膜形成;可致菌体细胞发生不可逆转的塌陷扭曲;能破坏细胞膜完整性,增大细胞膜通透性,使胞内核酸和蛋白质大量泄露,还可干扰DNA正常合成,阻滞蛋白质合成表达。因此,茶皂素有望成为食品加工中针对食源性腐败酵母的一种天然食品防腐剂,该研究也可为拓展天然防腐剂在高渗食品中的应用提供理论依据。     

桉叶精油对水产品中4种微生物的抑菌效果及抑菌机理

本文研究了桉叶精油对水产品中4种微生物的体外抑菌活性及其抑菌机理。通过滤纸片法和倍比稀释法分别测定抑菌圈直径(DIZ)和最低抑菌浓度(MIC),分析植物精油(桉叶精油、薄荷精油、茶树精油、丁香精油)对水产品中4种常见微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、腐败希瓦氏菌和副溶血性弧菌)的抑菌效果;进一步以腐败希瓦氏菌和金黄色葡萄球菌为研究对象,通过扫描电镜、透射电镜、电导率、核酸含量、细胞内ATP含量分析植物精油的抑菌机理。结果表明,桉叶精油对大肠杆菌、腐败希瓦氏菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为33.33、27.87、38.88、39.61 mm,对大肠杆菌、腐败希瓦氏菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为1.00、1.25、0.75、0.63 μL/mL,在4种植物精油中显示出最强的抗菌活性。桉叶精油改变了腐败希瓦氏菌和金黄色葡萄球菌的细胞形态和超微结构,加了细胞膜的通透性,破坏了细胞膜的完整性,造成细胞内容物的泄露及细胞生理功能紊乱,从而导致细菌的死亡。本实验将为桉叶精油作为一种天然抑菌物质应用于水产品行业提供理论依据。     

茶槲寄生“螃蟹脚”醇提正丁醇萃取相对金黄色葡萄球菌抑菌机理的研究

本文研究了茶槲寄生“螃蟹脚”醇提各萃取相的抑菌作用及正丁醇萃取相（NVBEs）对金黄色葡萄球菌的抑菌机理。采用滤纸片扩散法测定抑菌圈直径（DIZ）的大小,对倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）,来评价“螃蟹脚”醇提各萃取相对金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）、单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）4种食源性腐败菌的抑制性;通过光学显微镜和扫描电镜观察、胞膜通透性、胞壁完整性和酶活性等实验,研究了NVBEs抑菌机理。结果表明,“螃蟹脚”醇提各萃取相对S. aureus、E. coli、S. typhimurium和L. monocytogenes均有明显抑制效果,其中NVBEs抑菌活性较好,对S. aureus抑制效果最好,DIZ为9.84±0.57 mm,MIC为3.52 mg/mL,MBC为7.04 mg/mL。抑菌机理结果表明：NVBEs可增加S. aureus细胞壁及细胞膜的通透性,破坏菌体细胞结构,引起细胞内含物如核酸和蛋白质等外泄;引起遗传物质DNA的改变,使菌体细胞形态结构出现异常;影响菌体酶的代谢活动,从而抑制细菌的生长。     

丁酸钠对副溶血性弧菌毒性的影响及机制研究

目的 探究丁酸钠对副溶血性弧菌毒性的影响及机制。方法 通过测定丁酸钠对副溶血性弧菌生物膜形成能力及黏附宿主细胞能力, 评估其对副溶血性弧菌毒性的影响; 此外基于傅里叶变换红外光谱法和拉曼光谱法检测胞外成分变化;利用RT-qPCR探究毒力基因转录水平变化。结果 亚致死浓度的丁酸钠基本不影响副溶血性弧菌生长,但对生物膜形成有显著地抑制作用; 丁酸钠处理后,副溶血性弧菌对Caco-2细胞的黏附率分别降低28%、41%和61%; 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和拉曼光谱表明丁酸钠能影响副溶血性弧菌脂肪酸及蛋白质疏水性以及降低核酸、碳水化合物和蛋白质的峰面积; RT-qPCR分析显示丁酸钠可显著下调与副溶血性弧菌毒力相关基因的转录表达。结论 丁酸钠具有一定的抑制副溶血性弧菌毒性的能力, 有潜力用于预防及控制副溶血性弧菌造成的食源性疾病。     

黄精与土霉素协同抑制副溶血弧菌研究

为了抑制对虾养殖急性肝胰脏坏死病（AHPND）的主要病原菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），本论文用药食同源的天然草本黄精和8种水产用抗生素联合抑制副溶血弧菌，通过棋盘法测定黄精和抗生素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和联合抑菌效果，研究了黄精等对细菌细胞膜电导率、膜电位和存活率的作用，采用RT-PCR研究了黄精等对细菌外排泵相关基因表达的影响。结果表明，黄精和土霉素具有较好的协同抑菌效果，最佳配比为1/8 MIC黄精+1/4 MIC土霉素，此时分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration ，FIC）为0.38，但在羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）的存在下，这种协同作用转为相加甚至无关作用。电导率、膜电位和碘化丙啶染色证明黄精能破坏副溶血弧菌细胞外膜，提高其渗透性，导致细胞内膜去极化，膜两侧质子梯度消失。黄精显著抑制副溶血弧菌5个外膜蛋白、5个反向协同运输子和11个RND外排转运子的表达，其中vpa0096（OmpW）下调497.51倍，vp0425（TolC）、vp2072（Na+/H+反向协同运输泵）、vp2665（Na+/Ca2+交换蛋白）、vp1092、vp0941、vp1178、vpa0344和vpa0809分别下调27.03倍、73.53、55.56、100.00、35.71、37.74、49.02和56.18倍。黄精降低TCA循环关键酶苹果酸脱氢酶（MDH）和琥珀酸脱氢酶（SDH）酶活，从而抑制副溶血弧菌体内TCA循环。土霉素是vp0425（TolC）的底物之一，黄精属于天然外排泵抑制剂，能将土霉素阻留在细胞内，提高土霉素的抑菌效果。黄精和土霉素协同作用于水产养殖的弧菌病，大幅度缩减土霉素使用浓度、残留风险和耐药性弧菌的出现，从而促进水产养殖的健康发展。     

水飞蓟素对副溶血性弧菌的抑制作用

目的 以两种副溶血性弧菌为研究对象,探究水飞蓟素对于副溶血性弧菌的抑制及其作用机制。方法 通过琼脂板稀释法和肉汤稀释法确定水飞蓟素对两株菌的最小抑制浓度（MIC）,然后进一步通过研究水飞蓟素在不同培养基上处理后的副溶血性弧菌的生长曲线、生物膜形成情况、细胞膜完整性及钾离子外流情况的变化,探究水飞蓟素在不同培养基上对副溶血性弧菌的抑制作用及可能的作用机制。结果 水飞蓟素能够抑制生物膜的形成,损害细胞膜,导致细胞变形,显著增加钾离子外流,来抑制副溶血性弧菌的生长,并且不同培养基的抑制作用是不一样的。结论 水飞蓟素能够对副溶血性弧菌产生较强的抑制作用,有作为天然的抗菌物质应用于食品工业的潜力。     

山楂果胶寡糖的抑菌性能及机理

采用抑菌圈法对不同聚合度的山楂果胶寡糖进行选择,测定了实验样品对5 种供试菌的最小抑菌浓度 （minimal inhibitory concentration,MIC）和最小杀菌浓度,绘制了供试菌的生长曲线来评定样品的抑菌效果;并 从菌体形态、胞膜通透性、胞膜完整性等方面阐述果胶寡糖抑菌的机理。结果表明：平均聚合度为3的果胶寡糖对 供试菌种的抑菌效果最为显著,尤其是对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌3 种供试菌的抑菌效果最为明 显,其MIC值分别为1.250、0.625、0.625 g/L。随着加入果胶寡糖质量浓度的增大,菌悬液的相对电导率也随之升 高,同时菌悬液中核酸和蛋白质含量增大,由此表明果胶寡糖的抑菌性能是由于其破坏了细菌胞膜的通透性和完整 性,致使内容物外漏进而影响其代谢活性,抑制细菌生长。因此山楂果胶寡糖可以作为天然防腐剂,抑制食品中腐 败菌和致病菌的生长,延长食品货架期。     

戊糖片球菌的抑菌与共凝聚能力及其对水体中副溶血性弧菌的净化效应

研究了7株戊糖片球菌对副溶血性弧菌的抑菌特性和共凝聚能力,探讨了不同抑菌和凝聚特性的戊糖片球菌的细胞形态特征及其对水体中副溶血性弧菌的影响。结果表明7株戊糖片球菌对副溶血性弧菌的抑制作用是同p H值乳酸的1.1~1.3倍,抑菌活性对过氧化氢酶、蛋白酶以及加热处理不敏感。戊糖片球菌对副溶血性弧菌的2 h共凝聚率在14.8~37.6%之间,具有显著菌株差异性,其中菌株F28-8达到37.6%,显著高于其它菌株(P0.01)。扫描电镜结果显示菌株F28-8具有独特的细胞表面结构和粘连模式。戊糖片球菌对水体中副溶血性弧菌具有促凝聚和减菌作用,副溶血性弧菌悬液经过F28-8处理60 h,上层悬液中的可培养细胞浓度比未经处理的对照组降低了3.1 Log10 CFU/m L,显著高于低凝聚性菌株H13(P0.01),而凝聚物中可培养细胞比对照组降低了1.6 Log10CFU/m L,与H13处理无显著差异(P0.05)。     

金属抗菌肽SIF4对金黄色葡萄球菌细胞通透性的影响机制

为探明金属抗菌肽SIF4对金黄色葡萄球菌细胞通透性的影响机制,从胞外碱性磷酸酶活性、细胞表面电位、细胞表面疏水性、细胞内膜通透性和胞内生物大分子泄漏等角度考察了SIF4对细胞通透性的影响。研究发现,SIF4可破坏细胞壁结构完整性,随着抗菌肽质量浓度和温育时间的延长,胞外碱性磷酸酶活性也同步增长,2MIC组与TritonX-100组无显著差异（P>0.05）;细胞表面电位与SIF4质量浓度呈负相关关系;细胞表面疏水性与SIF4质量浓度呈良好的量-效正相关关系;细胞内膜通透性与抗菌肽质量浓度和温育时间呈正相关;胞内生物大分子泄漏与抗菌肽质量浓度和温育时间呈正相关,温育1 h时,胞内蛋白质泄漏呈差异性显著（P<0.05）,温育3 h后,2MIC与TritonX-100细胞内生物大分子泄漏差异基本不显著（P>0.05）。结果表明,SIF4可增强细胞通透性并使胞内物质泄漏,还能增强细胞表面疏水性和降低细胞表面电位,使细胞聚沉并诱导细胞坏死。