Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

耐热普鲁兰酶真菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

本研究从西藏羊八井热泉下游淤泥中筛选得到了一株高产耐热普鲁兰酶菌株YBJ10-2,经诱导后其最高产酶量可达55.732U/mL,是目前国内外发现的产酶量较高的真菌。根据形态特征及18S rDNA序列同源性分析,初步判定菌株YBJ10-2属于球孢枝孢菌。该菌株发酵所产耐热普鲁兰酶在65-75℃和pH 5.0-8.0条件下较稳定,最适pH值为6.5,最适温度为72℃,对普鲁兰糖和支链淀粉催化能力最强,具有广阔的开发应用前景。     

一株产普鲁兰酶菌株的筛选鉴定、酶学性质及海带多糖酶解产物的抗氧化活性

本研究从连云港海泥中筛选产普鲁兰酶菌株,利用形态学、生理生化特征、基因序列(16S rRNA和 gyrB)进行分析鉴定。利用产酶菌株发酵制备普鲁兰酶,初步纯化后分析其酶学性质。利用该普鲁兰酶粗提物对海带多糖进行水解,并对其水解产物进行抗氧化活性分析。结果表明:筛选得到一株产普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium),经发酵纯化后普鲁兰酶比活力为62.3 U/mg,分子量约为43 kDa。该酶的最适反应温度为45 ℃,最适pH为6.5,在温度40 ℃下保温5 h,相对残余酶活达95%以上,而60 ℃下保温1 h,酶全部失活。在pH6~7.5之间保温12 h后,该酶仍有40%以上的相对残余酶活。DPPH和·OH自由基清除实验表明:海带多糖经普鲁兰酶水解后抗氧化活性显著增强(p<0.05),为普鲁兰酶在食品工业中的应用研究提供了新的方向。     

Enterobactersp．SYA2乳糖酶酶学性质研究

采用硫酸铵盐析对Enterobactersp．SYA2乳糖酶进行分级沉淀,研究了该酶的最适作用温度、热稳定性、最适作用pH、pH稳定性及金属离子的影响。结果表明：选取硫酸铵的饱和度30％～85％进行分级沉淀,分级沉淀后得到乳糖酶的比活为45．85U／mg;该酶最适作用温度为40℃～45℃,在35℃和40℃处理时酶活损失不大,在45℃和50℃处理时酶活损失较大,最适作用pH为6．5,pH在6．0－8．5酶活最为稳定,Mg^2＋、Mn^2＋、Na^＋对该酶有一定激活作用,Zn^2＋,Cu^2、Fe^2＋对该酶有不同程度的抑制作用,当酶添加量为1U／mL,乳清水解率3h达50％;而添加量为2U／mL时乳清水解率1h达50％。     

嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质

用PCR方法扩增得到嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)XQ3506的普鲁兰酶编码基因Gs P,在大肠杆菌中进行异源表达。在没有外源信号肽的条件下,重组酶部分分泌到周质中,少量分泌到培养液中。重组酶表观分子量约为81 k Da,纯酶比活力为38.2 U/mg。重组酶最适温度为60℃,能短时耐受70℃高温;重组酶最适pH6.5,在pH5.5~7.5的范围内具有较好的稳定性;重组酶Km值为0.086μmol/L,Vmax为0.083μmol/min;K+和Mg~(2+)对重组酶有激活作用,而Ca~(2+)则有抑制作用。重组酶水解普鲁兰糖产物为单一麦芽三糖,对直链淀粉未发现降解作用,是一种I型普鲁兰酶。重组酶Gs P在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝酶法生产工艺中有一定的应用前景。     

嗜热古菌Thermococcus sp.HJ21产高温普鲁兰酶条件和酶学性质

对一株分离自热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp. HJ21)菌株产普鲁兰酶的条件及酶学性质进行了研究.结果发现:该菌株在18 h产酶量达到最高.在发酵温度为88 ℃、培养基初始pH 6.5,以及NaCl质量浓度为2.5 g/dL时,产酶较高.麦芽糖、酵母粉和蛋白胨有利于普鲁兰酶的产生.该酶的最适作用温度为95 ℃,在80～100 ℃之间仍可保持较高的酶活性;该酶具有较好的热稳定性,100 ℃保温2 h,仍有50%以上的残余酶活.该酶的最适作用pH为6.0,并且在pH 5.0～7.0之间可以保持较高酶活性;在pH 5.0～7.0之间较稳定,在pH 6.5时稳定性最好.Ca2+和Na+对普鲁兰酶具有较强的激活作用,而Al3+、Ni2+、Hg2+、Cu2+等则强烈抑制酶的活性.     

鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

试验研究皱纹盘鲍内脏中β-葡萄糖苷酶的分离纯化技术,以及pH、温度及金属离子和某些抑制剂对β-葡萄糖苷酶活性的影响。结果表明,以硫酸铵分级盐析鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶,选取30%饱和度的硫酸铵初步盐析除杂,80%饱和度的硫酸铵沉淀,能使鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的初步纯化效果最佳;经SDS-PAGE分析,透析后的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶纯度较高,分子量约为54.0~76.0 k Da;β-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃,最适pH为3.5,在小于50℃、pH 3.0~6.0下均能保持稳定;Zn~(2+)、Cu~(2+)和Ag+对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶活性有明显的抑制作用;Na~+、K~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)和Fe~(2+)对酶活性影响不明显;Ba~(2+)、EDTA和Mn~(2+)对酶活均有激活作用,其中,Mn~(2+)激活作用最强。以p-NPG为底物,β-葡萄糖苷酶动力学常数Km为4.66 mmol/L,Vmax为3.79 U/L。     

一株关中热泉液口普鲁兰酶产生菌的筛选鉴定及部分酶学性质研究

[目的]筛选性能良好的产普鲁兰酶的菌株,对菌株进行多项分类鉴定,初步分离所产生的普鲁兰酶并进行性质研究。[方法]利用糯米粉作唯一碳源分离纯化普鲁兰酶产生菌,通过形态特征观察、生理生化测定、16S r RNA序列分析等实验确定菌株的分类地位。利用硫酸铵沉淀法得到粗酶,分析了酶的最适温度、最适p H、温度和p H稳定性、Na Cl等的耐受性。通过加入普鲁兰多糖诱导物优化培养基,提高普鲁兰酶产量。[结果]从我国陕西地下热泉样品中分离得到的一株普鲁兰酶产生菌WSCF46,经过多项分类鉴定显示其是与Vibrio parahaemolyticus亲缘性最近。菌株WSCF46所产的普鲁兰酶反应最适p H为5.0,最适温度60℃,经诱导培养优化后平均酶活达2.7U/m L。[结论]多项分类结果鉴定菌株为Vibrio parahaemolyticus strain ATCC17802,该菌株产普鲁兰酶相关报道在国内为首次。普鲁兰酶产量较其他来源的酶相比较高,具有进一步研究价值。     

普鲁兰酶产生菌的分离与鉴定

以淀粉工业用普鲁兰酶的开发为目的，采集全国不同地区的土壤样本，分离其中的嗜中温细菌，经过形态学鉴定后，通过16SrDNA最终确定其属种并建立细菌库。对该细菌库中短短芽胞杆菌所产普鲁兰酶进行了初步的酶学研究，研究表明野生短短芽胞杆菌的初始酶活都很低，有几株其初始产酶水平大于1U／mL。酶学性质研究表明，短短芽胞杆菌普鲁兰酶有较好的应用价值，其最适作用pH在4～6之间，最适作用温度在50℃～60℃之间，其中来源于CICIM B1490的普鲁兰酶，其酶学性质与目前使用黑曲霉糖化酶的酶学性质相似，能够作为以后研究的初发菌株。     

普鲁兰酶的分离纯化及部分酶学性质

对盐球菌(Halococcus sp.)Z1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产的普鲁兰酶粗酶液的耐热耐酸性进行了比较研究,并采用(NH4)2SO4盐析、透析、DEAE-Sephadex A25阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤对Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶进行分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果表明Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在低于65℃和pH4.0~7.5范围内有很好的稳定性,最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0~5.4,相对分子质量为8.17×104,Km值为0.24 mg/mL。     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca2+、Zn2+和Mg2+能够促进酶的活性,其中Ca2+激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。     

产普鲁兰酶蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及酶学性质研究

利用选择性培养基从广西南宁淀粉加工厂附近土壤中分离出一株具有产普鲁兰酶能力的野生菌株GXBC-2。该菌株革兰染色为阳性,形成芽孢,菌体细胞杆状,结合生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为Bacillus cereus GXBC-2。对该菌所产普鲁兰酶的性质研究表明:酶的最适反应温度为50℃,在30～50℃范围内稳定,最适pH为7.0,稳定pH范围为6～8.5。产物经HPLC分析证明,该酶能水解普鲁兰糖产生麦芽三糖,对可溶性淀粉不起作用,所以该酶属于I型普鲁兰酶。     

普鲁兰酶产生菌的筛选

从啤酒厂附近的土壤中分离产脱枝酶的菌株,通过筛选得到一株产普鲁兰酶的菌株PUG12.对其产酶条件进行了初步优化,其发酵64 h时产酶活力最大,达到2.45 U/mL.初步研究了酶性质,其产生的普鲁兰酶反应最适温度为45℃,反应最适pH为8.2,在50℃以下和pH6.4～9.4条件下较稳定.     

黑曲霉B0201生料发酵产单宁酶的提取及酶学性质研究

对黑曲霉B0201利用五倍子为诱导物生料发酵产胞外单宁酶的提取及酶学性质进行了研究.结果表明:硫酸铵两步沉淀的饱和度为40%和90%;该酶的最适温度为40℃,最适pH为5.0,低于60%时的热稳定性高,60℃以上迅速失活.Zn~(2+)、Mg~(2+)、吐温80、EDTA等对酶活力无明显影响,Fe~(3+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ba~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Al~(3+)等对酶有抑制作用.以没食子酸丙酯(PG)为底物,单宁酶的米氏常数Km为0.514mmol/L,Vmax为71.8μmol/L·min.     

嵌合突变嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶结构域B对酶学性质及功能的影响

为考察嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)普鲁兰酶结构域B对热稳定性及其他酶学特性和功能的影响,采用嵌合蛋白技术将B.acidopullulyticus普鲁兰酶的结构域B置换为Geobacillus thermoleovorans普鲁兰酶结构域B。嵌合突变体在60℃下的半衰期由34.9 min提高至168.4 min,解折叠一半时的温度由65℃提高至72℃,嵌合突变体较野生型具有更加优良的动力学稳定性和热动力学稳定性。结构域B置换后,最适pH碱向偏移至pH6.5,最适温度提高至70℃。比酶活及底物特异性实验结果显示,嵌合突变削弱了酶分子与普鲁兰多糖的结合,转而有利于与糊精及可溶性淀粉的结合。淀粉糖化结果显示,嵌合突变不影响突变体的实际应用性能。上述结果表明,B.acidopullulyticus普鲁兰酶结构域B对酶蛋白酶学性质影响显著,可通过同源置换构建适合于不同淀粉糖化工艺的突变体。     

商品普鲁兰粗酶的分离纯化

对商品普鲁兰酶进行分离纯化。用已购得的商品普鲁兰酶,制成酶液,采用硫酸铵进行分级盐析,通过脱盐、离子交换层析和凝胶色谱,分离得到较纯的普鲁兰酶。通过SDS-PAGE电泳分析,获得了单一条带,表明所分离的酶已经达到电泳纯,该酶的分子量约为82kDa。     

浓香型大曲中蛋白酶菌株的分离及酶学性质研究

从浓香型大曲中分离得到1株产蛋白酶优势菌株,并将该菌所产蛋白酶经硫酸铵分级沉淀、透析、吸附树脂处理,得到蛋白酶粗酶。对该酶的最适pH值、pH值稳定性、最适温度、温度稳定性、金属离子影响等进行研究。结果表明,该菌株产蛋白酶的最适pH值为7,pH值稳定性较差;最适温度为40℃,热稳定性随温度增加而降低;金属离子Li+和螯合剂EDTA对该酶具有抑制作用,金属离子Mn2+、Fe3+、Cu2+、K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+等均对该酶具有激活作用,其中Zn2+对该酶的激活作用最强。     

米曲霉氨基酰化酶的纯化及粗酶性质研究

利用硫酸铵分级盐析法从米曲霉L-09中提取氨基酰化酶,比活力为56.01 U/mg,纯化倍数为2.06,酶活力回收率为80%。详细研究该粗酶的酶学性质。结果表明,经盐析法提纯的粗酶最适pH为7,最适反应温度为55℃,在55℃下热稳定性良好。溶液中的金属离子对酶活力有很大影响。其中,高浓度的Fe~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)对酶活力有抑制作用,低浓度的Co~(2+)离子对酶活力有激活作用。     

酿造酱油米曲霉产中性蛋白酶提取与酶学性质研究

对米曲霉菌种F-81所产中性蛋白酶的提取及部分性质进行了研究.结果表明硫酸铵分级沉淀的饱和浓度范围为40%～80%;该中性蛋白酶的最适作用温度为 60 ℃,最适pH 值为 7.0.40 ℃下酶稳定性较好,60℃下处理 20 min,粗酶中几乎检测不到酶活力;中性蛋白酶pH 稳定范围为 6.0～8.0.Km值为2.84 mg/mL;最大反应速度Vmax为0.32 mg/(min·mL).Mg2 对酶活有激活作用,Cu2 、Fe3 、Zn2 、Mn2 不同程度抑制酶活性,其中Cu2 、Fe3 强烈抑制酶活性.     

解淀粉芽孢杆菌I型耐热普鲁兰酶的纯化及酶特性分析

对来源于菌株解淀粉芽孢杆菌HxP-21的普鲁兰酶（命名为PulBa）分离纯化，研究其酶学特性，为普鲁兰酶在淀粉加工中的应用提供理论基础。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析从菌株HxP-21发酵液中分离纯化出一种新型的普鲁兰酶。酶的纯化倍数20.8，回收率53.2%，比活力176.5 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得PulBa达到电泳纯，分子质量51.2 kDa。PulBa在45～70 ℃和pH 3～6范围内具有较高酶活力，最适反应温度55 ℃、pH 4.5。PulBa有良好的pH值稳定性和热稳定性，40～70 ℃孵育120 min保留最初活性的80%以上；pH 3～7范围内具有很高的稳定性，孵育6 h后仍保留60 U/mL以上活性。PulBa对各种金属离子和化学试剂表现出不同的敏感性，Mg2＋和Ca2＋能够显著增强酶活力。PulBa最适作用底物为普鲁兰糖，对马铃薯支链淀粉、玉米支链淀粉、可溶性淀粉和糖原也有一定水解活性，但对α-环糊精和β-环糊精和直链淀粉无活性。以普鲁兰糖为底物PulBa的Km和Vmax值分别为1.34 mg/mL和24.6 μmol/（min·mg）。研究表明PulBa是典型的I型普鲁兰酶。薄层层析进一步证明，PulBa专一性水解支链淀粉α-1,6-糖苷键，产生麦芽三糖。本研究确定了一种新型的普鲁兰酶，该酶在高热稳定性和酸性环境下具有高活性，在淀粉加工等生物技术产业中有较好的应用潜力。