锦葵色素葡萄糖苷和锦葵色素半乳糖苷抑制内皮细胞氧化应激作用

目的：研究血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelialcells,HUVEC）中活性氧（reactive oxygen species,ROS）、黄嘌呤氧化酶-1（xanthine oxidase-1,XO-1）、血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性的影响,确定最佳AngⅡ诱导浓度,探讨不同浓度锦葵色素葡萄糖苷（malvidin-3-glucoside,Mv-3-glc）和锦葵色素半乳糖苷（malvidin-3-galactoside,Mv-3-gal）对AngⅡ诱导的血管内皮细胞氧化应激的抑制作用机理。方法：通过体外培养HUVEC,采用酶联免疫吸附分析法分别测定HUVEC中SOD活力、XO-1和HO-1含量,并采用荧光探针方法检测细胞中ROS水平变化。结果：在HUVEC中,AngⅡ可诱导XO-1的表达,抑制HO-1的表达,AngⅡ在浓度10－2 μmol/L时对HUVEC氧化应激诱导最为显著。不同浓度的Mv-3-glc、Mv-3-gal及其混合物均可显著抑制AngⅡ诱导的内皮细胞氧化应激,通过抑制XO-1蛋白过表达,增加HO-1和SOD表达量,改善细胞抗氧化防御系统,从而减少细胞内ROS水平,达到氧化保护作用,且Mv-3-glc比Mv-3-gal抗氧化活性更强。结论：锦葵色素葡萄糖苷和锦葵色素半乳糖苷具有抑制内皮细胞氧化应激的作用。     

反油酸对人脐静脉内皮细胞活力的影响

目的：观察反油酸对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖活力的影响。方法：采用50、100、200、400、600μmol/L 等5 个浓度的反油酸作用于人脐静脉内皮细胞,以正常组为阴性对照组,NaOH 组(200μmol/L)为阳性对照组,MTT 法和台盼蓝排斥实验检测其对内皮细胞的毒性。结果显示：反油酸组内皮细胞增殖活力明显低于正常组,且高浓度组(400、600μmol/L)对细胞增殖抑制率明显高于低浓度组(50μmol/L);而NaOH 组与正常组比较却无明显差异。此外,反油酸组活细胞率降低。结论：反油酸对内皮细胞有明显毒副作用,其生长抑制率与反油酸浓度和作用时间呈正相关。     

外源L-Arg处理对蜜橘果实贮藏品质的影响

用100、200 μmol/L外源L-精氨酸（L-arginine,L-Arg）溶液浸泡处理蜜橘果实10 min,探讨该处理对采后蜜橘果实贮藏品质的影响。结果表明,适宜浓度（200 μmol/L）的外源L-Arg处理可以有效抑制蜜橘果实黄化,在一定程度上抑制果皮细胞膜透性的增加;在贮藏的前28 d内,L-Arg浸泡处理能够维持果实可溶性固形物的含量;各处理组之间的呼吸速率没有显著性差异,适宜浓度（200 μmol/L L-Arg）的L-Arg浸泡处理能够在一定程度上抑制蜜橘果实质量损失率的增加;延缓果实总酚、抗坏血酸含量的减少,贮藏前期（0～21 d）处理组果实果肉类黄酮含量与对照组之间无显著差异,贮藏后期（28～35 d）处理组果实类黄酮含量显著低于对照组果实。即200 μmol/L外源L-Arg处理能够在一定程度上有效延缓采后蜜橘果实的衰老和品质下降。     

活性氧影响单核细胞增生李斯特菌对7721肝癌上皮细胞的侵袭

用还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶抑制剂二苯基氯化碘盐（diphenyleneiodonium chloride,DPI）处理单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）后,用2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯荧光法测定L. monocytogenes中的活性氧（reactive oxygen species,ROS）,结果显示细胞内源性ROS明显降低且有DPI浓度依赖性。进而用ROS产生能力降低的L. monocytogenes侵袭7721肝癌上皮细胞,结果显示：在1～10 μmol/L的DPI浓度范围内,随着L. monocytogenes内ROS水平的降低,L. monocytogenes侵袭7721上皮细胞的能力却随之增长。本研究提示：L. monocytogenes可能和高等动植物一样存在类似于负责产生ROS的NADPH氧化酶,由其介导产生的ROS可能调控L. monocytogenes侵袭细胞的能力。     

活性氧与蜡样芽孢杆菌菌膜形成的相关性

为阐明活性氧（ROS）与蜡样芽孢杆菌菌膜形成的相关性,以市售原料奶中分离的蜡样芽孢杆菌分离株为目标菌,以细菌中NADPH氧化酶介导产生的ROS为主要靶点,用外源ROS补充剂过氧化氢(H₂O₂)、ROS清除试剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、NADPH氧化酶抑制剂二苯基氯化碘盐（DPI）处理蜡样芽孢杆菌,测定分析ROS变化与菌膜形成之间的关系。结果表明,0.01 μmol/L H₂O₂、1 μmol/L H₂O₂、100 μmol/L H₂O₂处理组平均菌膜形成量均显著高于对照组平均菌膜形成量（P<0.05）,0.1 μmol/L H₂O₂、10 μmol/L H₂O₂处理组平均菌膜形成量与对照组平均菌膜形成量相比无显著性差异（P>0.05）,随着H₂O₂浓度的升高,ROS逐渐下降。NAC各处理组平均菌膜形成量均显著高于对照组平均菌膜形成量（P<0.05）,随着NAC浓度的升高,ROS逐渐下降。DPI浓度≤1 μmol/L时,随着DPI浓度的升高,平均菌膜形成量均显著高于对照组平均菌膜形成量（P<0.05）,ROS逐渐下降;DPI浓度>5 μmol/L时,随着DPI浓度的升高,平均菌膜形成量显著低于对照组平均菌膜形成量（P<0.05）,ROS含量升高。表明在不影响蜡样芽孢杆菌生长和细胞活性的前提下,一定浓度的H₂O₂、NAC和DPI处理菌株能够诱导ROS减少,增强蜡样芽孢杆菌菌膜的形成。激光共聚焦显微镜结果显示,与对照组相比处理组具有更强的染色效果,呈现红色的网络结构,而未经处理组呈现松散的结构和更少的菌膜生物量,这表明ROS对蜡样芽孢杆菌菌膜的形成存在抑制作用。     

桂花多酚对TNF-α诱导下HUVEC炎症反应保护作用的研究

通过建立体外肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)炎症损伤反应模型,研究桂花多酚纯化组分1、2、3对炎症细胞的活性(MTT)、活性氧(ROS)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和黄嘌呤氧化酶(XOD)活性影响;以10μg/L TNF-α诱导HUVEC产生炎症反应,加入6000μg/L、3000μg/L、300μg/L和30μg/L桂花多酚纯化组分1、2、3,研究桂花多酚纯化组分1、2、3的浓度及其组成对炎症细胞保护作用的影响。结果表明,当桂花多酚纯化组分2、3浓度为300~3000μg/L、组分1浓度为3000μg/L时,可显著提高由TNF-α诱导的HUVEC细胞活力和SOD酶活性(p0.05),显著抑制炎症细胞中活性氧(ROS)含量和XOD酶活性(p0.05),具有显著抗炎效果。     

人参寡肽抗苯并芘诱发肺上皮细胞炎性损伤研究

本研究从人参中提取获得人参寡肽,解析其氨基酸序列;利用CCK-8技术筛选保护人肺上皮II型（A549）细胞免受苯并芘（Benzopyrene,Bap）损伤效果最好的寡肽;流式细胞术检测人参寡肽-1（Renshen Oligopeptides-1,RSO-1）在10 μmol/L及50 μmol/L浓度下对浓度为10 nmol/L的Bap导致的A549细胞凋亡、线粒体膜电位降低和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）含量增加的影响;蛋白免疫印迹验证10 nmol/L浓度的Bap对A549细胞芳香烃受体（Aromatic Hydrocarbon Receptor,AHR）、NF-κB与MAPK信号通路及AP-1因子的影响,并检测了RSO-1在10及50 μmol/L浓度下对Bap毒性的抑制作用。结果表明,10 nmol/L的Bap暴露诱发A549细胞氧化应激（与空白对照组相比具有显著性差异,P<0.05）,激活芳香烃受体（Aromatic Hydrocarbon Receptor,AHR）和NF-κB信号通路并诱发细胞凋亡（与空白对照组相比具有显著性差异,P<0.05）。而浓度为10和50 μmol/L人参寡肽（Ginseng Oligopeptide,RSO,RSO-1~氨基酸序列-EGHGF）均可抑制Bap暴露导致的AP-1因子表达及芳香烃受体（AHR）和NF-κB的激活,从而抑制Bap暴露导致的细胞凋亡（与Bap组相比均具有显著性差异,P<0.05）。本研究对人参的应用及深层次开发提供理论依据。     

染料木黄酮抑制3T3-L1细胞成脂分化机制

目的：研究染料木黄酮是否通过雌激素受体介导影响3T3-L1前脂肪细胞成脂分化,并探讨其可能的机制。方法：以不同浓度染料木黄酮处理3T3-L1细胞,四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法测定细胞存活率;在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中分别加入不同浓度染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780（一种雌激素受体抑制剂）混合物及不同浓度雌二醇,油红染色观察分化结果,测定细胞甘油三酯（triglyceride,TG）含量;染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780混合物及不同浓度雌二醇处理诱导成熟后的脂肪细胞,测定培养液甘油含量;分别用染料木黄酮（30 μmol/L）、染料木黄酮（30 μmol/L）和ICI182780混合物干预细胞成脂分化,Western blotting法检测细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、p-ERK、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）、p-AMPK、激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase,HSL）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）蛋白表达量。结果：3T3-L1细胞存活率随染料木黄酮浓度的升高而降低,50～200 μmol/L染料木黄酮能抑制细胞生长（P＜0.01）;染料木黄酮能负向调节成脂分化后细胞胞浆内TG含量,在0～50 μmol/L浓度范围内呈剂量依赖关系,高剂量雌二醇（100 nmol/L）能下调TG含量;染料木黄酮能促进成熟脂肪细胞脂解,提高细胞培养液甘油浓度;染料木黄酮（30 μmol/L）能上调p-AMPK、HSL蛋白表达,下调FAS蛋白表达（P＜0.01）,对ERK、p-ERK、AMPK表达量无明显影响（P＞0.05）。ICI182780（1 μmol/L）能部分阻断染料木黄酮（30 μmol/L）对p-AMPK的调节作用（P＜0.05）。结论：染料木黄酮能抑制3T3-L1细胞成脂分化,其机制可能是染料木黄酮一方面下调FAS蛋白表达,抑制脂肪合成,另一方面激活AMPK-HSL途径促进脂肪分解;染料木黄酮还可能通过非雌激素受体途径抑制3T3-L1细胞成脂分化。     

PCR 方法检测河豚鱼的引物筛选及反应体系优化

根据Genbank 公布的河豚鱼细胞色素b 基因序列,应用软件Primer Premier 5.00 版设计了7 对引物,经过PCR 筛选,确定可以在所有8 个供试河豚鱼样品中检出目的DNA 片段的引物HT-1,用于建立河豚鱼的PCR 检测方法。对该PCR 方法中6 个因素包括退火温度、Mg2+ 终浓度、Taq DNA 聚合酶用量、dNTPs 终浓度、引物终浓度和模板DNA 用量进行优化,确定优化的PCR 扩增体系：10 × PCR 缓冲液2μL,MgCl2 终浓度1.5mmol/L,Taq DNA 聚合酶1.0U,dNTPs 终浓度300μmol/L,引物终浓度0.2μmol/L,DNA 模板400ng,加纯水至总体积20μL。扩增程序定为94℃预变性5min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,40 个循环,72℃延伸5min。据此建立河豚鱼成分PCR 检测方法,并通过河豚鱼与非河豚鱼的PCR 检测结果比较,验证了该方法的河豚鱼特异性。研究结果还表明,该方法的检出限为0.1%,含量为0.1% 的河豚鱼样品PCR 检出率至少在97.5% 以上。     

壬基酚致NCTC1469细胞的损伤作用及活性氧水平、谷胱甘肽含量变化

目的：探究壬基酚对NCTC1469细胞的损伤作用及细胞内活性氧类、还原型谷胱甘肽含量的影响。方法：通过体外细胞实验,用不同质量浓度壬基酚作用NCTC1469细胞24 h;CCK-8法检测细胞存活率;测定药物作用后培养液上清中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）活性及细胞内还原型谷胱甘肽含量;流式细胞仪检测细胞内活性氧类水平。结果：壬基酚可显著抑制NCTC1469细胞增殖及促进活性氧类生成（P＜0.05）,呈一定剂量依赖性;培养液上清液中LDH、ALT活性在壬基酚浓度大于0.1 μmol/L处理组中,与自然释放对照组相比显著升高（P＜0.05）;且壬基酚在高剂量（1、10、100 μmol/L）能明显增加培养液上清中AST活性（P＜0.01）;壬基酚呈剂量依赖性降低细胞内还原型谷胱甘肽含量,与空白对照组比较有显著差异（P＜0.05）。结论：推测壬基酚可能通过上调细胞内活性氧类水平,下调胞内还原型谷胱甘肽含量,引起氧化应激反应,从而对NCTC1469细胞产生损伤作用。     

榆干离褶伞溶栓酶对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的：探讨榆干离褶伞（Lyophyllum ulmarium,L.u）溶栓酶对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞（humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC）损伤的保护作用。方法：用H2O2诱导HUVEC氧化损伤,采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法观察细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位（ΔΨm）和总活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;Western blotting法检测Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3等蛋白的表达水平。结果：L.u溶栓酶可显著提高HUVEC的存活率,明显抑制H2O2诱导的细胞内ROS生成和线粒体跨膜电位的下降,并能降低Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表达水平。结论：L.u溶栓酶对氧化应激损伤的HUVEC有保护作用,其机制可能与抑制细胞凋亡有关。     

野生桃金娘主要抗氧化成分及其抗氧化能力

本实验研究了野生桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）的抗氧化能力、总多酚含量、总黄酮含量、抗坏血酸含量和花青素类成分。采用超高效液相串联光电二极管阵列（photo-diode array,PDA）检测器和离子肼质谱法（ultra performance liquid chromatography coupled to photo-diode array and ion-trap mass spectrometry,UPLC-PDAIT-MS）鉴定花青素类化合物,通过高通量的自由基清除方法测定抗氧化能力。结果表明：野生桃金娘具有较高的抗氧化能力。每克桃金娘的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力相当于67.2 μmol的抗坏血酸和28.5 μmol没食子酸;过氧化氢自由基清除能力（PSC单位）相当于23.2 μmol的抗坏血酸和14.3 μmol没食子酸;2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid） ammonium salt,ABTS）自由基（ABTS+·）清除能力相当于30.4 μmol的抗坏血酸和7.8 μmol没食子酸;对三价铁的还原能力相当于28.7 μmol的抗坏血酸和3.1 μmol没食子酸。野生桃金娘的总多酚含量和总黄酮含量分别是4 976 mg 没食子酸/100 g（以干质量计）和49.7 mg儿茶酚/100 g（以干质量计）,总抗坏血酸含量是9 mg/100 g（以鲜质量计）。总花青素含量相当于414 mg矢车菊素/100 g（以干质量计）,共有飞燕草素3-O-葡萄糖苷等7 种花青素类化合物被鉴别出来。     

氯化钙处理对速冻蓝莓冻藏期品质的影响

研究不同质量分数氯化钙处理对速冻蓝莓果实于－18 ℃冻藏时品质变化的影响。结果表明：随着冻藏时间延长,速冻蓝莓果实的质量、硬度、可溶性固形物（TSS）、可滴定酸、VC、花色苷和总酚含量均呈下降趋势。浸钙处理可延缓速冻蓝莓果实质量、硬度、TSS、可滴定酸、VC、花色苷和总酚含量的下降,保持果实原有品质。在整个冻藏期多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性不断下降,氯化钙处理组冻藏后期PPO活性明显被抑制,但对POD活性没有显著效果。综合分析各指标,经1.5%氯化钙溶液处理的速冻蓝莓其冻藏期品质最好。     

AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞建立高血压损伤模型

目的:采用高血压发病因子血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)建立高血压损伤模型。方法:使用不同浓度(0.01、0.10、1.00μmol/L和10.00μmol/L)AngⅡ诱导HUVECs不同时间(3、6、9、12 h和24 h),通过考察HUVECs形态、活性、功能、微观结构及凋亡程度来评价HUVECs损伤程度,同时采用交叉设计方差分析和多重比较方法得到AngⅡ最适诱导浓度和最佳诱导时间。结果:AngⅡ呈浓度依赖式诱导HUVECs损伤,最佳诱导条件为1.00μmol/L AngⅡ诱导12 h,此时HUVECs活性为44.85%、NO含量为43.57μmol/L、总一氧化氮合酶活力为6.99 U/mg pro、内皮型一氧化氮合酶活力为1.89 U/mg pro、丙二醛含量为7.46 nmol/mL、超氧化物歧化酶活力为27.29 U/mg pro、细胞凋亡率为41.5%,微观结构显示核膜皱缩,核仁消失,胞浆内出现大量空泡状结构,线粒体或细小或肿胀,粗面内质网扩张数目较少,部分核糖体丢失,平面内质网扩张,但细胞未解体,仍然保持细胞结构。结论:1.00μmol/L AngⅡ诱导12 h可以成功诱导HUVECs建立高血压损伤模型。     

竹盐酿造酱油对H2O2诱发LLC-PK1细胞氧化损伤的保护作用

目的：研究竹盐酿造酱油乙醇提取物对H2O2诱发猪肾近曲上皮小管细胞（pig proximal tubular cell）LLC-PK1氧化损伤的保护作用。方法：以不同质量浓度（10～200 μg/mL）的竹盐酿造酱油乙醇提取物预培养LLC-PK1细胞24 h后,换用含500 μmol/L H2O2的DMEM细胞培养液继续培养4 h建立细胞氧化损伤模型。四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测细胞生存率,硫代巴比妥酸比色法测定细胞内丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量,比色法测定细胞内过氧化氢酶（catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性和谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量。结果：经不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物预处理24 h后,受损细胞的生存率上升,细胞内MDA生成量减少,ROS水平显著降低。同时,细胞内抗氧化酶（CAT、SOD和GSH-Px）的活性及其mRNA转录水平,GSH含量也较未经竹盐酿造酱油乙醇提取物处理的受损细胞增加。结论：竹盐酿造酱油乙醇提取物可以通过提高细胞内抗氧化酶系的活性和抗氧化物质GSH的含量而有效地对抗H2O2诱发的LLC-PK1细胞氧化损伤。