酿酒酵母异源合成己二酸

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘生物,将来源于嗜热菌Thermobifida fusca B6中的己二酸逆降解途径基因搭配不同的酿酒酵母组成型启动子和终止子,构建在3个穿梭质粒上,并导入宿主细胞,成功实现了己二酸的异源合成。将AA-1菌株在YPD培养基中发酵,得到3. 39 mg/L己二酸,是同一宿主中已报道的最高值。同时,敲除了酿酒酵母TCA循环关键基因LSC1,但未能使己二酸产量提高。通过发酵实验,研究了生物量、副产物乙醇与己二酸产量的联系;并通过改变初始碳源浓度对乙醇和己二酸产量进行了研究,为进一步提高己二酸产率、降低酿酒酵母葡萄糖效应提供了参考依据。     

酿酒酵母代谢调控合成功能营养品：进展与挑战

综述了酿酒酵母作为底盘细胞代谢调控合成功能营养品的研究进展。首先,介绍了酿酒酵母作为细胞工厂相关的启动子调控、终止子调控、辅因子调控、转运蛋白调控及动态调控等一系列代谢调控策略,并介绍了加强产物合成的相关遗传改造工具和代谢分析技术。随后,概述了酿酒酵母合成寡糖、维生素及萜类、短链有机酸和脂肪酸等功能营养品的研究进展。最后,提出了目前面临的挑战,并结合代谢工程新兴技术展望了未来酿酒酵母代谢调控的发展趋势,以期为功能营养品在酿酒酵母中的高效合成提供参考。     

重组产番茄红素大肠杆菌工程菌株中异戊烯异构酶(IDI)基因的筛选

番茄红素是一类在食品、医药等领域具有广泛应用价值的萜类化合物。异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)是番茄红素合成途径中的关键酶,也是代谢工程改造的主要靶点。本研究为了系统比较不同来源IDI对重组大肠杆菌番茄红素(Lycopene)产量的影响,分别克隆了原核微生物、真核微生物、植物、古菌等多种来源的I型及II型异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)基因,在大肠杆菌E.coli中异源表达,在加强自身2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)代谢途径的背景下,通过优化多靶点组合及转化时间提高番茄红素的合成水平。结果表明酿酒酵母来源的I型IDI(Sc IDI)及枯草芽孢杆菌来源的II型IDI(Bs IDI)在经优化的背景下可以获得最高的番茄红素产量,产量分别达到9.96 mg/g DCW,8.78 mg/g DCW,番茄红素积累在转化8 h达到最高,最高能达到10.29 mg/g DCW。本研究最终确定了不同类型IDI发挥功能的条件,为后续番茄红素以及萜类化合物的代谢途径的改造提供依据。     

酿酒酵母异源合成柠檬烯的研究进展

植物萜类化合物是以异戊二烯为结构单位的一大类植物天然的次生代谢产物。柠檬烯属于单萜类化合物,具有抑菌、增香、抗癌、止咳、平喘等多种功能,因此在食品、药品、化妆品、医疗等领域具有广泛的应用前景。目前柠檬烯的生产主要是从植物中提取,受到季节性原材料、产物分离纯化复杂、产率低等因素的限制,而化学合成又存在能耗高、污染严重等缺点。随着合成生物学技术的兴起,诞生了以微生物生物合成法生产柠檬烯的新方法,该方法具有能耗低、绿色环保、可持续等优势。然而微生物法合成柠檬烯也存在低产量、低效率等问题,这就限制了其商业化,因此构建高效的异源合成柠檬烯微生物细胞工厂,实现微生物发酵法替换传统的植物提取法,具有重要的经济与社会效益。本文主要回顾了近几年利用代谢工程改造酿酒酵母异源合成柠檬烯取得的成就,阐述了以酿酒酵母作为底盘微生物,利用代谢工程和合成生物学的手段构建高产柠檬烯的合成策略,还讨论了如何减轻柠檬烯对宿主细胞的毒性和提高宿主对柠檬烯的耐受性。     

代谢工程改造酿酒酵母促进L-苯丙氨酸的合成

通过代谢工程改造酿酒酵母L-苯丙氨酸合成相关途径,强化L-苯丙氨酸合成并实现胞外积累,为后续深入挖掘酿酒酵母芳香族氨基酸合成和转运机制,利用酿酒酵母生产芳香族氨基酸及其高价值衍生物提供参考。首先对酿酒酵母中心代谢途径和莽草酸途径进行代谢改造,获得1株合成L-苯丙氨酸初步强化菌株,测得胞外L-苯丙氨酸和L-酪氨酸产量分别为2.49和6.54 mg/L。为了进一步增强L-苯丙氨酸的积累,敲除L-苯丙氨酸消耗途径基因ARO10和PDC5。最后,敲除TYR1阻断竞争性L-酪氨酸合成途径,胞外L-苯丙氨酸产量提高至45.40 mg/L,这是目前研究酿酒酵母L-苯丙氨酸从头合成的最高胞外产量。     

微生物合成蒎烯的研究进展

蒎烯是自然界中广泛存在的单萜类化合物,在自然界中主要以α-蒎烯和β-蒎烯两种形式存在,被广泛应用于食品、能源、化工、军事、医药和材料等领域,具有重要的应用价值和发展前景。目前蒎烯的获得途径主要是通过从植物松节油中进行高效精馏分离提取,但是这种方式具有成本高、效率低、操作工艺复杂、污染环境等弊端。所以,随着微生物学代谢工程和发酵工程的发展,利用底盘生物构建蒎烯代谢通路来生产蒎烯已经成为一种重要趋势。该文主要总结了目前蒎烯在大肠杆菌和酿酒酵母中的合成途径以及提高蒎烯产量的策略,并且说明了提高宿主菌株对蒎烯的耐受性对蒎烯合成的影响,提出了蒎烯生物合成存在的问题以及解决思路,对未来蒎烯在生物中合成提供了参考和启示。     

番茄红素及其生物合成途径的研究

介绍番茄红素具有的理化特性和生理功能,植物中番茄红素的生物合成途径及其调控。由于番茄红素的特定分子结构,使其具有抗癌、保护皮肤、延缓衰老等功能特性,是对人类健康有益的食物成分。而随着番茄红素合成途径的阐明及对其合成调控的研究,运用基因工程手段调控番茄红素的生物合成已成为现实。     

过量表达NADH氧化酶降低酿酒酵母乙醇合成的研究

目的:为了降低在葡萄酒酿造过程中酿酒酵母的乙醇产量。方法:将编码NADH氧化酶的Spnox基因过量表达于酿酒酵母T73中,构建胞内异源NADH氧化途径。结果:与出发菌株酿酒酵母T73/p Y26相比较,重组菌株酿酒酵母T73/p Y26-Spnox胞内总NADH氧化酶活性提高49%,胞内NADH/NAD+比率降低了9%;酿酒酵母T73/p Y26-Spnox发酵模拟葡萄汁所获得的乙醇产量及醇类物质总量分别降低了7%和13%,挥发酸增加了4.5%,挥发性物质种类和含量略有增加。结论:过量表达NADH氧化酶可使葡萄酒在发酵条件下,酿酒酵母合成乙醇或其它醇类物质的能力降低,为进一步优化葡萄酒发酵条件生产降醇葡萄酒打下基础。     

代谢改造酿酒酵母生产葡萄糖二酸

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,通过表达来源于拟南芥的肌醇加氧酶基因miox4和来源于丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶基因udh,在酿酒酵母细胞中构建葡萄糖二酸的生物合成途径。通过将拟南芥miox4基因和丁香假单胞菌udh基因整合到酿酒酵母基因组中的delta位点上,葡萄糖二酸产量高达3. 80 g/L,是目前报道的酿酒酵母细胞中葡萄糖二酸的最高产量。这种方法可以广泛用于酿酒酵母细胞的代谢工程研究。     

CRISPR/Cas9介导的果糖低消耗酿酒酵母工程菌的构建

利用酿酒酵母为宿主,以果糖为原料合成D-阿洛酮糖具有食品方面的先天优势。为了减少酿酒酵母宿主本身对果糖的消耗,对酿酒酵母的己糖激酶同工酶2(Hexokinaseisoenzyme2,hxk2)基因进行编辑。本研究采用CRISPR/Cas9技术,构建了Cas9和gRNA共表达质粒p YES2-CG-Δhxk2,以酿酒酵母BY4741为出发菌株,URA3为筛选标记,采用高效电击转化法和胞内同源重组技术,获得hxk2基因缺陷株BY4741-Δhxk2。在此基础上,进行果糖发酵实验以评估突变菌株的果糖消耗速率。实验结果显示,发酵培养14 h时,缺陷株BY4741-Δhxk2果糖消耗速率为3.35 mg/h;与野生型菌株相比其下降了6.42%。此外,发酵培养22 h,BY4741-Δhxk2的OD600nm值为8.65,相比于野生型提高了6.40%。研究表明,己糖激酶hxk2基因的缺陷编辑可以一定程度降低酿酒酵母对果糖的利用,同时缺陷株较野生型表现出一定的生长优势,这为后续以酿酒酵母为宿主生产D-阿洛酮糖奠定了初步基础。     

产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株的构建

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是一种天然存在的非蛋白质类氨基酸,在医学和农业领域应用广泛。为构建生产ALA的酿酒酵母细胞工厂,作者首先在酿酒酵母中分别表达了来源于酿酒酵母和类球红细菌中编码ALA生物合成C4途径ALA合酶的hem1和hemA基因,同时又表达了来源于大肠杆菌编码C5途径关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨醛氨基转移酶的基因hemA和hemL。结果表明,表达酿酒酵母自身来源的hem1基因更利于ALA的合成,ALA产量为327.6 mg/L。在此基础上将C4和C5途径的基因hem1、hemA和hemL在酿酒酵母中过量表达,在添加前体物质甘氨酸和琥珀酸的条件下,ALA产量为525.8 mg/L,实现了在酿酒酵母中合成ALA。     

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素脱氢酶(Pds)是番茄红素合成的关键酶,本研究通过PCR 法获取pds 基因和E8 启动子序列,将目的基因和E8 启动子序列构建到植物表达载体pMD1 中,构建了含果实特异表达启动子的pds 基因的植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明：番茄果实特异性表达pds 的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105 中,为下一步pds 在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

大肠杆菌中吡咯喹啉醌合成途径的构建

目前吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）在大肠杆菌中的异源合成主要以质粒为表达载体进行,但是质粒载体难以进行合成途径多基因表达的系统优化,并且容易造成发酵不稳定。作者以大肠杆菌为底盘生物,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在基因组水平系统优化PQQ的合成。将来源于Gluconobacter oxydans 621H的操纵子pqqABCDE引入底盘大肠杆菌,并进一步通过优化合成途径基因表达强度,敲除大肠杆菌自身抑制基因及强化PQQ的胞内需求与胞外转运等,获得了一株能够高效合成PQQ的工程菌,摇瓶发酵72 h时产量达到86.3 mg/L。以大肠杆菌为底盘构建PQQ高效合成途径的工作能够为后续以其他底盘生物生产PQQ及相关代谢产物提供借鉴。     

卷枝毛霉Δ12-脱饱和酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的高效表达

Δ12-脱饱和酶是亚油酸合成的关键酶,为提高Δ12-脱饱和酶的活性,本研究利用RT-PCR对Mucor sp.EIM-10的Δ12-脱饱和酶c DNA进行克隆,并导入p YES2.0质粒中,构建重组表达载体。运用醋酸锂转化法将重组质粒导入酿酒酵母,成功构建p YMD12酿酒酵母表达系统。为了进一步提高Δ12-脱饱和酶的表达水平,用GAP启动子替代p YES2.0质粒自带的启动子,成功构建p YGAPMD12重组菌。最终产物经GC-MS检测显示,p YGAPMD12重组菌转化C18∶1的转化率为69.172%,比p YMD12重组菌提高32.771%。本文为进一步提高Δ12-脱饱和酶的表达水平提供参考依据。     

生物合成己二酸的代谢工程研究进展

己二酸是一种重要的大宗化学品,主要用于合成尼龙和聚氨酯泡沫塑料,市场需求巨大,其高效生物合成至今还未实现。本文概括了酿酒酵母中构建和优化新的己二酸合成途径研究进展。首先,通过体内及体外活性测试,对催化每一步反应的酶进行筛选,构建初步的代谢途径。利用组学分析诊断和定位生物合成途径的瓶颈。对于途径中的限速酶采用蛋白质工程手段进行改造。其次,利用合成生物学和代谢工程手段优化代谢途径。优化手段具体包括:通过模块化优化,平衡各个基因之间的表达;利用蛋白支架,构建酶反应的流水线,减少中间产物的扩散,提高反应效率;通过RNA干扰技术抑制竞争代谢途径的流量,提高目标代谢途径的通量。最后,利用CRISPR/Cas9及全局转录机器工程(gTME)等最新技术进行基因组编辑、重排转录网络,最终获得己二酸的高产菌株及适用于高效生产其他芳香族化合物的底盘酵母菌株。     

酿酒酵母表面展示技术表达酸性蛋白酶

为解决白葡萄酒蛋白不稳定性问题,实现酸性蛋白酶的利用与酒精发酵的同步进行,本研究以酿酒酵母单倍体菌株BY4741和二倍体菌株82-9-35为宿主菌,通过酵母表面展示系统中的启动子和锚定蛋白的作用在酵母细胞表面表达酸性蛋白酶.将来源于宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因(pepA)克隆,构建表达酸性蛋白酶的细胞展示盒,利用同源重组定...     

油酸促进粗糙脉孢菌发酵高产番茄红素的条件优化北大核心CSCD

微生物发酵法生产番茄红素是直接提取和化学合成的有效替代策略。以油酸为外源脂肪酸,探究其对粗糙脉孢菌发酵产番茄红素的影响,通过响应面法优化确定最佳培养条件,并进一步探究油酸对番茄红素合成相关酶的影响。结果表明:在含油酸的培养基中,粗糙脉孢菌的番茄红素产量显著增加;在油酸质量浓度0.90 g/L、振荡速率100 r/min、振荡培养温度34℃、静置培养温度30℃条件下,番茄红素产量达到4.21 mg/L,是空白对照组的2.77倍。培养基中油酸的添加不仅促进了粗糙脉孢菌生物量的积累,菌体内乙酰辅酶A的水平也显著增加;同时,与番茄红素合成相关酶(HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、香叶基香叶基焦磷酸合酶)的水平亦显著升高。结果表明油酸的添加可供利用更多的乙酰辅酶A进入甲羟戊酸途径,并进一步在上述酶的诱导作用下促进番茄红素的合成。     

番茄红素热异构化机制及其影响因素研究进展

番茄红素是来自植物性食物中最重要的类胡萝卜素之一,它具有抗氧化、预防前列腺癌和心血管疾病的功 能。生鲜植物性食品中的番茄红素主要为全反式构型,但研究表明全反式番茄红素的生物活性和生物利用率不及其 顺式异构体。因此,利用食品加工技术（光照、加热、氧化、改变pH值、添加表面活性剂）促进食品中番茄红素 的异构化对提升产品营养品质具有重要意义,其中热处理是最方便、最经济的方式。本文在论述番茄红素热异构化 作用机制的基础上,分别对模拟体系和食物体系中的番茄红素热异构化的影响因素（溶剂种类、加热温度、加热时 间等）进行探讨,并得出溶剂种类和食物基质对番茄红素热异构化影响较大,提高温度或延长加热时间可促进番茄 红素异构化甚至使其发生降解的结论。最后提出了该领域研究中存在的问题及今后的研究方向。     

高效液相色谱法测定番茄及其制品中的番茄红素

番茄红素是一种天然红色素 ,主要存在于番茄、西瓜、葡萄等蔬菜、水果中。与 β -胡萝卜素一样 ,番茄红素也是种类众多的类胡萝卜家庭中的一员。番茄红素不仅是天然、无毒、安全、理想的食品色素 ,80年代后期研究结果更表明 :番茄红素还具有优越的生理功能。[1～ 3 ]由于人体组织不能自身合成番茄红素 ,必须通过摄入加以补充 ,其中最主要的来源就是番茄及其制品 (番茄酱、番茄沙司、番茄汁等 ) ,因此应对番茄及其制品中番茄红素的含量进行准确定量。长期以来 ,番茄红素的测定均是以光谱法为基础 ,[4,5] 依靠前处理除去黄色素等各种杂质 ,再…     

生物合成柑橘类黄酮研究进展

因柑橘中类黄酮化合物含量丰富,具有多种生理活性功能而被广泛应用于食品、药品、化妆品等行业。类黄酮主要从柑橘等植物中提取,少量通过化学合成或结构修饰。近年来,在大肠杆菌、酿酒酵母等宿主菌中构建代谢通路异源合成类黄酮的微生物方法已进入研究阶段,其具有安全性高,绿色环保,可持续发展的特点。本文简述了柑橘中类黄酮的合成代谢途径,微生物合成柚皮苷、橙皮苷、圣草次苷等类黄酮的研究进展及技术思路,对宿主菌代谢负荷大、基因表达效率偏低、碳通量流向不平衡等问题,提出优化宿主菌株选择、微生物共培养、表达体系优化及碳通量重定向等解决方案,以期对目前柑橘类黄酮的微生物合成研究提供参考。