假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶基因的克隆及表达

利用聚合酶链式反应从假肠膜明串珠菌中扩增出甘露醇脱氢酶（mannitol dehydrogenase,MDA）基因的结构基因,克隆入表达载体pETDuet-1,构建了甘露醇脱氢酶表达质粒pETDuet-1-mdh,将其转化进入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶结构基因长度为1 017 bp,重组甘露醇脱氢酶基因在大肠杆菌内成功表达,其蛋白质分子质量为36.0 kD;重组甘露醇脱氢酶活力为0.15 U/mg pro,高于假肠膜明串珠菌中甘露醇脱氢酶活力0.03 U/mg pro。     

乳制品中明串珠菌的分离鉴定及其生物学特性研究

对内蒙古自治区呼伦贝尔市牧区98个乳样中的明串珠菌进行了分离及生物学特性研究。共分离到明串珠菌3株，分别属于乳明串珠菌(EW21)，肠膜明串珠菌葡聚糖亚种(EW24—2)和肠膜明串珠菌肠膜亚种(CB8—1)。它们均可在pH=4．8的环境中生长，且菌株EW24—2和CB8—1可利用蔗糖生成葡聚糖。     

碳酸饮料絮凝物的微生物分离及其耐酸性研究

从碳酸饮料的絮凝物中分离出的微生物,经过形态学特征及生理生化特性分析,获得了3株明串珠菌属菌株,鉴定为:假肠膜明串珠菌1株,肠膜明串珠菌葡聚糖亚种2株。对3株菌株进行了pH3.0的耐酸性研究,其中3#呈现出最强的耐酸性和碳酸饮料的适应性。     

乳酸菌红色荧光蛋白融合表达系统的构建

目的:构建以红色荧光蛋白基因(dsred2)为标记的乳酸菌融合表达系统p MG36e-dsred2,并以α-淀粉酶(amy)为报告基因实现融合基因dsred2-amy在乳酸菌内的融合表达。方法 :通过PCR的方法以质粒p PIC9kdsred2为模板扩增得到dsred2基因的全部编码区序列,并将其连接到克隆型载体p MG36e上,得到重组载体p MG36e-dsred2。以地衣芽孢杆菌基因组为模板,扩增只带有起始密码子而不带有终止密码子的α-淀粉酶基因(amy),将其连接到克隆型载体p MG36e-dsred2上,获得融合表达载体p MG36e-dsred2-amy。最后将该载体电转化干酪乳杆菌,利用荧光显微镜观察红色荧光基因表达情况,用淀粉平板检测淀粉酶活性。结果:通过PCR的方法分别扩增到大小为694bp的红色荧光蛋白基因(dsred2)和大小为1 554 bp的淀粉酶基因(amy)。将获得的两个基因片段进行测序,结果与NCBI数据库进行对比,dsred2基因的匹配率为100%,amy基因同源性为99.54%。成功构建了乳酸菌表达系统p MG36e-dsred2及融合表达载体p MG36e-dsred2-amy。在荧光显微镜下观察菌体有荧光且淀粉平板上有明显的透明圈。结论:融合表达载体的构建成功为乳酸菌在生物体内的定植、分布、存活等研究提供了方法,也为研究外源蛋白在乳酸菌内的表达的分泌(细胞内、细胞壁、细胞外表达)、活性检测等奠定了基础。     

肠膜明串珠菌及其近缘种dnaA和rpoB基因的系统发育分析

比较16S r RNA基因、dna A、rpoB部分基因序列对Leuconostoc mesenteroides(Leu.mesenteroides)及其近缘种的分辨力,为肠膜明串珠菌提供快速准确的鉴定方法。以分离自自然发酵乳制品中的8株Leu.mesenteroides为研究对象,以其看家基因dnaA、rpoB部分基因序列作为分子标记,结合Gene Bank数据库中的近缘种及亚种的相应序列构建系统发育树,并与16S r RNA基因的系统发育树进行比较。研究发现,基于Leu.mesenteroides及其近缘种的dna A和rpo B部分基因序列构建的系统发育树的拓扑结构与16S r RNA基因基本一致,但分辨率高于16S r RNA基因;种间的dna A和rpo B部分基因序列相似性分别为81.7~84.8%和85.5、87.4%,而种间16S r RNA基因相似性为98.1%~99.5%。相较于16S r RNA基因,dna A和rpo B基因更容易鉴定肠膜明串珠菌及其近缘种,其中rpo B可明晰区分试验菌株与肠膜明串珠菌亚种间的系统发育关系,因此rpo B基因可作为16S r RNA基因的辅助工具用于Leu.mesenteroides及其近缘种的快速鉴定。     

一株肠膜明串珠菌的分离筛选及其合成葡聚糖培养条件的优化

从四川泡菜中分离筛选出一株产葡聚糖的菌株,命名为M81,鉴定结果为Leuconostoc mesenteroides(肠膜明串珠菌)。选取接种量、初始p H、培养温度为3个实验因素,葡聚糖产量为响应值,在单因素基础上采用响应面法设计实验,优化肠膜明串珠菌M81合成葡聚糖的培养条件。最优培养条件为:接种量4.0%,初始p H为8.0,培养温度为27.0℃,此时葡聚糖产量为60.55 g/L。     

传统四川泡菜发酵过程中明串珠菌的分离鉴定

分别以红皮萝卜、卷心菜、豇豆为原料,用自然发酵法制作了三种四川泡菜。对三种泡菜发酵过程中的明串珠菌进行分离,主要得到四种不同形态的菌株,将其分别命名为:MC-1、MC-2、MC-13、J-5,其中J-5为豇豆泡菜特有,其余为三种泡菜共有。采用生理生化结合16SrDNA序列鉴定对分离的菌株进行鉴定,依次鉴定为:乳明串珠菌(L.lactis)、肠膜明串株菌葡聚糖亚种(L.mesenteroides subsp.dextranicum)、柠檬明串珠菌(L.citreum)、假肠膜明串珠菌(L.pseudomesenteroide)。对发酵过程中明串珠菌动态分析表明:L.lactis、L.mesenteroides subsp.dextranicum为三种泡菜中的主要优势明串珠菌;L.citreum在发酵第2~4d出现后很快又消失;L.pseudomesenteroide在豇豆发酵的第3~9d比较活跃;泡菜发酵到第11d,泡菜水中所有的L.lactis都消失。     

肠膜明串珠菌BD1710在TSM中的产糖条件优化

研究了肠膜明串珠菌BD1710(L.mesenteroides BD1710,CGMCC NO.6432)以TSM为基料时,接种量、初始p H、番茄汁浓度、蔗糖浓度、发酵温度对多糖产量的影响,同时,比较了肠膜明串珠菌BD1710在最优条件下发酵TSM和CDM的多糖产量,并对所获得的多糖组成进行了分析。结果表明:肠膜明串珠菌BD1710发酵TSM产多糖的最适条件分别为接种量2.0%(体积分数)、初始p H 7.0、番茄汁浓度100%(体积分数)、蔗糖浓度15%、发酵温度28℃。在优化条件下,肠膜明串珠菌BD1710的多糖产量最高可达32.15 g/L,与在CDM中多糖的产量相当。采用乙醇沉淀的方法从BD1710发酵TSM得到的多糖碳水化合物含量为97.54%,蛋白质含量为0.72%。因此,TSM可替代CDM来应用于明串珠菌合成多糖。     

肠膜明串珠菌及其近缘种dnaA和rpoB基因的系统发育分析北大核心CSCD

比较16S r RNA基因、dna A、rpoB部分基因序列对Leuconostoc mesenteroides（Leu.mesenteroides）及其近缘种的分辨力,为肠膜明串珠菌提供快速准确的鉴定方法。以分离自自然发酵乳制品中的8株Leu.mesenteroides为研究对象,以其看家基因dnaA、rpoB部分基因序列作为分子标记,结合Gene Bank数据库中的近缘种及亚种的相应序列构建系统发育树,并与16S r RNA基因的系统发育树进行比较。研究发现,基于Leu.mesenteroides及其近缘种的dna A和rpo B部分基因序列构建的系统发育树的拓扑结构与16S r RNA基因基本一致,但分辨率高于16S r RNA基因;种间的dna A和rpo B部分基因序列相似性分别为81.7~84.8%和85.5、87.4%,而种间16S r RNA基因相似性为98.1%~99.5%。相较于16S r RNA基因,dna A和rpo B基因更容易鉴定肠膜明串珠菌及其近缘种,其中rpo B可明晰区分试验菌株与肠膜明串珠菌亚种间的系统发育关系,因此rpo B基因可作为16S r RNA基因的辅助工具用于Leu.mesenteroides及其近缘种的快速鉴定。     

传统发酵牦牛酸乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定

目的:以四川红原、西藏羊八井地区传统牦牛酸乳中分离出的57株乳酸菌作为实验菌种,筛选出高产胞外多糖乳酸菌。方法:通过菌落拉丝法、硫酸-苯酚法的测定。结果:实验菌株胞外多糖产量在19.95~91.08μg/m L之间,其中菌株代号为32-2、67-1、41-1和27的胞外多糖产量较高,分别为91.08、89.76、87.22、87.40μg/m L。通过16S r DNA序列同源性鉴定表明代号32-2菌株鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)、代号67-1菌株为肠膜明串株菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、代号41-1菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、代号27菌株为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。结论:为研究具有提高酸乳品质能力的发酵菌株提供依据。     

肠膜明串珠菌发酵饲料的制备工艺及其在泌乳奶牛中的应用

选用不同比例混合的豆粕、玉米粉、菜粕、棉粕作为原料,采用高产赖氨酸和蛋氨酸的肠膜明串珠菌菌株进行发酵研究,通过正交实验,初步确定肠膜明串珠菌发酵奶牛饲料的工艺:27℃,p H值6.7,接种量5%,培养时间为32 h,在此条件下固态、液态饲料中总蛋白、赖氨酸和蛋氨酸质量分数最高,奶牛适口性最佳,具有一定的营养保健和增乳作用。     

发酵香肠中分离纯化的三株乳酸菌产酸特性研究

为了研究从发酵香肠中分离纯化的3株乳酸菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的产酸性能,对这3株菌在不同pH、温度、NaCl、NaNO2条件下的生长情况及产酸情况进行了测定。研究结果显示:这3株菌中,肠膜明串珠菌和戊糖片球菌的生长特性较好;粪肠球菌的生长特性虽不如肠膜明串珠菌和戊糖片球菌,但产酸能力最好,戊糖片球菌耐盐性最好、肠膜明串珠菌耐亚硝酸盐的特性最好;在不同温度和pH条件的测试中,肠膜明串珠菌的生长能力最好,粪肠球菌次之。这3株乳酸菌在发酵肉制品中均产生乳酸。总之,这3株菌均具有用于发酵制备乳酸的能力。     

一株高产酸乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究

利用MRS选择性培养基从豆清发酵液中分离筛选乳酸菌。经初筛得到5株乳酸菌,通过比较不同乳酸菌在同一条件下的p H和产乳酸量复筛得到一株产酸较高、p H较低的优势产酸乳酸菌,对其编号为M-6。根据菌株的形态学观察、生理生化试验以及16S r RNA基因序列分析鉴定,初步将该菌株鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides strain M-6)。对其进行生物学特性研究,发现菌株M-6的最适生长温度在30℃,适宜p H范围为5.5~8.5,菌株在该温度下发酵20 h后菌液OD600nm高达1.2917,p H低至4.16(总酸),且菌株M-6有一定的耐盐受性,当Na Cl浓度大于3%时,菌株生长受到明显抑制。因分离得到的肠膜明串珠菌M-6具有较强的产酸能力,可利用其发酵制备豆腐凝固剂,在豆制品生产领域具有良好的应用前景。     

食品级高产亮氨酸氨肽酶重组Bacillus subtilis的构建和发酵优化

为解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵产亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)需额外添加抗生素的问题,该研究构建了1株食品级产LAP重组B. subtilis。首先通过Cre/lox系统敲除B. subtilis 168基因组中D-丙氨酸消旋酶基因(dal)得到缺陷型菌株BS168 (dal)~-。其次使用高斯组装的方法构建以dal作为标记基因的质粒pMA5-lap-dal (Amp~R,Ori)-并转化至BS168 (dal)~-中得到食品级重组菌BS168 (dal)-/p MA5-lap-dal (Amp~R,Ori)~-。该工程菌发酵产LAP无需添加抗生素且不含抗性基因。对该菌株进行5 L发酵罐条件优化,在转速300 r/min、温度33℃、p H 7. 0、分阶段补料的条件下,酶活最高达到302 U/m L。结果表明,构建的食品级重组B. subtilis产LAP具有潜在的工业应用前景。     

肠膜明串珠菌的研究和应用进展

肠膜明串珠菌是乳酸菌中的明串珠菌属的重要菌种。研究证实,肠膜明串珠菌能发酵糖类产生多种酸和醇,具有高产酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力。目前肠膜明串珠菌已被广泛应用于风味剂、血浆代用品,还有望成为新型微生态制剂。     

新疆不同地区开菲尔粒中乳酸菌的分离鉴定及筛选

以新疆不同地区采集的7种开菲尔粒作为分离源,通过形态观察、16Sr DNA序列分析,分离出27株乳酸菌,其中有22株开菲尔乳杆菌,3株肠膜明串珠菌和2株假肠膜明串珠菌。对27株菌通过初级筛选:酸度、持水率、感官评价,筛选出10株酸度适宜、持水率高并且风味及组织状态好、感官评价高的乳酸菌。通过次级筛选:后酸化能力、产乙醛和双乙酰能力、冷藏期间活菌数,最终筛选得到4株性能优良的乳酸菌,包括3株开菲尔乳杆菌NR2、XR3、TXR4和1株肠膜明串珠菌XR1。因此这4株菌可作为乳品工业复合菌种发酵剂的优良配伍菌株使用,可为酸乳风味提供更多的选择。     

单菌与多菌接种发酵对多轮发酵四川泡菜风味的影响

以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)以及食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)为出发菌株,pH、总酸、挥发性风味成分和感官评价为指标,研究3种单菌及多菌对多轮发酵四川泡菜风味品质的影响。结果表明,与自然发酵相比,接种发酵均能快速启动发酵,稳定泡菜品质;3种单菌产酸速度为肠膜明串珠菌>食窦魏斯氏菌>植物乳杆菌。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技术共检出挥发性风味成分85种,其中包括醇类27种、醛酮类17种、酯类16种、酸类2种、烃类13种、含硫化合物2种、苯环类5种、其他化合物3种;共分析出16种重要挥发性成分,包括二甲基三硫、二甲基二硫醚、桉叶油醇、芳樟醇、α-松油醇、壬醛、正辛醛、正葵醛、乙偶姻、异硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基异硫氰酸酯、3-(甲硫基)丙基异硫氰酸酯、三芥子酸甘油酯、乙酸...     

基于尿嘧啶磷酸核糖转移酶为负向筛选标记的生酮古龙酸杆菌基因组无痕修饰系统的构建

通过构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)敲除打靶质粒,采用同源重组的方法获得了生酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)的upp基因缺失突变株K.vulgareΔupp,可作为基因组无痕修饰系统底盘细胞的upp基因表达载体,转化突变株K.vulgareΔupp,获得upp基因回补菌株PBB-upp,并验证了upp作为负向筛选标记的可行性。实验结果表明:突变株Δupp在1 mg/m L的5-氟尿嘧啶培养基上可生长,野生型和回补菌株PBB-upp不能生长,3株菌对5-氟尿嘧啶的抗性存在显著差异,说明可以将upp基因作为负向筛选标记,与正向筛选标记相结合,在upp基因缺失的底盘细胞基础上通过两次同源重组,实现基因组的无痕修饰与改造。     

自然发酵豆酱中明串珠菌的分离鉴定

分离筛选传统发酵豆酱中的明串珠菌,研究其益生特性。以采集自东北6 个地区的56 份自然发酵豆酱为研究对象,用稀释涂布平板方法对明串珠菌进行分离筛选,然后对疑似菌株进行形态学特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列进行分析,确定菌株种属序列,然后对鉴定得到的明串菌株进行耐酸耐胆盐性能比较。结果表明：从56?份豆酱样品中共分离到118?株疑似乳酸菌,从中得到6?株明串珠菌,鉴定3?株为乳酸明串珠菌,3?株为肠膜明串珠菌肠膜亚种。综合比较6?株明串珠菌耐酸耐胆盐性,发现菌株FX6益生性最好,在pH?3.0环境培养3?h后存活率可达85.16%,在含0.3 g/100 mL胆盐环境培养6?h后存活率高达96.07%。因此,菌株FX6可用于进一步科研以及工业应用,其在豆酱发酵过程的作用机理仍需深入研究。     

大头菜发酵菌株比例及发酵工艺优化

选择合适的发酵条件对大头菜发酵过程中的产酸和感官评价至关重要,首先进行菌株的组合优化,通过优势菌群的构建和发酵菌株的配比优化实验确定适合大头菜发酵的菌种比例为鼠李糖乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶短乳杆菌=3∶2∶3;然后以大头菜为原料进行乳酸菌接种发酵,通过单因素实验和正交试验最终确定大头菜的最佳发酵工艺条件为乳酸菌(鼠李糖乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶短乳杆菌=3∶2∶3)接种量2%,食盐浓度8%,发酵温度27℃,发酵时间90 d。