素食中动物源性成分的PCR检测方法的研究

建立了素食产品中动物源性成分的实时荧光PCR检测方法,该方法特异、灵敏,仅通过检测一个基因位点即可判断素食产品中是否含有动物源性成分,对来源于畜类、禽类及鱼类动物源性成分的检出限分别为0.01%,0.05%,0.1%。运用该方法对市场上22份不同类型的素食产品进行了检测,检出2份产品中含有动物源性成分。该方法操作方便快捷,适用于素食中动物源性成分的定性检测。     

应用LNA-TaqMan探针实时荧光PCR检测大米制品中转基因成分

大米制品中痕量转基因成分的检测需要特异和超灵敏的检测方法。本研究以行业标准中转基因大米筛查位点CaMV35S启动子、NOS终止子和Cry1A基因为目标,利用在常规TaqMan探针中掺入锁核苷酸提高探针退火温度和杂交特异性等特点,经比较以上位点不同LNA-TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测效果,建立了针对上述筛查位点的基于LNA-TaqMan探针的新型实时荧光PCR检测方法。该方法特异性强,检测灵敏度超高;与普通TaqMan实时荧光PCR方法相比,其反应Ct值可提前1～3 个循环（Cry1A位点除外）,检测低限可达3 pg。该检测方法可以用以检测大米制品中常规实时荧光PCR难以检测到的痕量转基因大米成分。     

实时荧光PCR定量检测加工产品中转基因玉米Mon810成分

采用实时荧光PCR技术，建立了定量(性)鉴定检测加工产品中转基因玉米Mon810成分的方法。实验设计的可以扩增玉米自身基因和外源基因边界序列的引物和探针具有品种和品系特异性，特异性地检测出食品、饲料等加工产品中转基因玉米Mon810成分。某些检测样品不仅检出转基因玉米Mon810成分，还同时检出其它转基因玉米品系或其它转基因品种。本研究实验建立的转基因玉米Mon810品系鉴定检测方法，即可以用于加工产品中转基因成分的定量检测(检测低限为0．1％)，也可以用于定性检测，或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测大豆转基因成分

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,建立了食品中大豆转基因成分的定量检测方法。通过设计特异引物,扩增内源参照基因lectin和转基因靶基因CP4EPSPS,建立两种基因的拷贝数-CT标准曲线,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量,并且通过熔解曲线分析扩增反应特异性。结果表明,lectin和CP4EPSPS基因标准曲线线性关系好,R2值分别为0.9984和0.9953,方法的回收率为95%～110%,检测限为0.01%。本检测方法具有快速、灵敏、准确、特异、高通量等优点,可以作为食品中大豆转基因成分的定量检测方法。     

进口薯格中转基因成分的检测

目的建立了一种快速检测进出口食品中转基因成分的方法。方法本实验采用DNA提取试剂盒对薯格中的DNA进行快速提取,接着用实时荧光PCR方法对其进行转基因成分和品系的鉴定。结果通过对食品标签进行初筛,发现其标识成分中含有未标明的转基因成分。进一步对所含转基因成分的品系进行鉴定,确定薯格的外包裹玉米粉中含有多种转基因成分,包括转基因玉米TC1507、NK603、MON810、59122、MON89034等5个品系。结论本文方法可以用于加工食品中转基因玉米成分及品系的定性检测,也可以作为常规PCR定性方法的确证试验方法。     

烘焙食品中转基因成分定性检测的FAPAS能力验证结果与分析

目的分析参加FAPAS烘焙食品中转基因成分定性检测能力验证的结果。方法根据FAPAS组织方提供的能力验证作业指导书、国家标准GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法(部分步骤改进)和行业标准SN/T1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》对一份烘焙食品测试样品进行转基因成分定性检测。结果该样品检出pCaMV35S、tNOS、GTS40-3-2和MON863品系(基因),未检出Bt11、Bt176、GA21、MIR604、MON810、MON88017、MON89034、MON89788、NK603和TC1507品系。结论本实验重点对核酸提取方法进行改进并严格质控,满足了烘焙食品这类加工样品转基因定性检测要求,获得能力验证结果为满意。     

实时荧光PCR法测定婴幼儿谷类辅助食品中麸质过敏原成分

目的建立实时荧光PCR法检测婴幼儿谷类辅助食品中麸质过敏原成分的含量。方法样品加入淀粉酶液化后,采用试剂盒方法提取样品DNA,考察大麦Hordein基因、小麦Gliadin基因、黑麦Secl基因和燕麦Avenin基因检测方法的特异性、灵敏度和检出限,幵应用于检测实际样品。结果确定了实时荧光PCR反应体系条件,各个基因的检测方法具有特异性强且灵敏度高,检出限为0.1%。结论该方法操作简便,准确率高,适用于婴幼儿谷类辅助食品中麸质成分的检测。     

食品过敏原牡蛎成分PCR检测方法的初步研究

目的:建立基于PCR技术的过敏原牡蛎成分快速检测方法,结合溶解曲线及特异的Tm值与Ct值,用于不同产品的牡蛎成分检测。方法:根据NCBI上的牡蛎线粒体序列,通过DNA Star等软件设计引物,分别采用普通PCR和SYBR Green I实时荧光PCR的方法建立食品过敏原牡蛎成分的检测方法,对十种牡蛎阳性样品和二十余种阴性样品进行实验,并且对几种牡蛎相关食品进行检测。结果:研究建立的检测方法可以检测出含牡蛎成分0.1%的样品,其中荧光PCR的灵敏度达到0.01 ng/μL,特征峰的Tm温度为80.08 ℃,能够检测出牡蛎相关食品中的牡蛎成分。结论:该方法是一种操作安全方便、成本较低、特异、灵敏的实时荧光PCR方法,对于收集到的食品相关产品以及保健品中牡蛎粉的检出率为100%,该方法可广泛应用于食品中牡蛎成分的快速鉴定。     

影响米粉干转基因成分荧光PCR检测的若干因素分析

为提高米制品中转基因成分实时荧光PCR检测的灵敏度与检出率,以及优化样品中转基因成分的检出效果,以添加不同转基因含量的米制品(米粉干)为模拟转基因样品,对影响检测效果的因素包括样品颗粒细度、DNA提取过程中样品在CTAB裂解缓冲液中温育时间等因素进行分析。结果显示,当样品颗粒细度>100目、CTAB温育时间达到8h条件下,样品DNA提取及荧光PCR检测结果最好;在最优化的条件组合下,样品转基因成分的检出限可达到0.001%转基因含量,是通常认为的荧光PCR检出限0.01%的10倍。     

进口玉米酒糟粕中转基因品系检测方法的比较研究

以美国进口玉米酒糟粕(DDGS)中转基因玉米品系MIR162的实时荧光PCR检测方法为研究内容,分别采用3种常见商业化试剂盒提取基因组DNA,采用3个检测标准中规定的实时荧光PCR方法进行MIR162定性检测,比较了9种方法组合在检测玉米酒糟粕中转基因成分的检测技术性能。结果表明,使用TIANGEN?植物基因组DNA提取试剂盒和《SN/T 1196—2012转基因成分检测玉米检测方法》规定的荧光PCR方法,检测灵敏度最高,符合现行检验监管法规要求。考虑到大宗农产品及其加工产品的国际贸易普遍存在转基因成分低水平混杂的情况,进一步探讨了进口农产品转基因成分检验监管分类管理的必要性,提出针对不同风险级别的进口农产品采用灵敏度相适宜的检测方法。     

可视化膜芯片检测转基因大豆的研究

目的研究可视化膜芯片技术对转基因大豆及其制品的检测能力,验证该技术的灵敏度及可行性。方法利用可视化膜芯片对转基因大豆及其制品进行检测,并采用行业标准要求的实时荧光PCR方法进行对比验证。结果该技术具备典型外源基因片段的判定能力,能够用于大豆及其制品中转基因成分的检测,方法检出限为0.1%,比对验证实际样品的检测结果与行业标准荧光PCR法一致。结论该技术便捷、直观、准确,可用于大豆及其制品的转基因成分快速初筛与鉴定。     

微滴式数字PCR和实时荧光PCR在豆奶饮料转基因成分检测中的应用

为探索数字PCR在转基因成分筛选检测中的应用,解决现行转基因食品标准实施中的问题,完善我国转基因食品的检测监管体系。本文选取转基因启动子Ca MV35s和终止子NOS基因为靶标,大豆内源基因Lectin为内标,以转基因大豆标准品分别测定数字PCR和实时荧光PCR的浓度和含量检测低限,并应用于30批次豆奶饮料转基因成分实测。结果表明,数字PCR在转基因筛查的浓度检测低限达到0.04ng/反应,含量检测低限达到0.05%,均优于实时荧光PCR(0.2ng/反应,1%),且能够满足最严欧盟转基因标识阈值0.9%的检测要求。在豆奶饮料实际应用中发现,26批次样品两个平台检测结果一致为阴性,1批次一致为阳性,3批次Ct值在34.59～38.28之间的样品经数字PCR检测得到确切结果,说明数字PCR可辅助确认RT-PCR可疑结果,解决现行标准判定难题。     

实时荧光PCR法测定婴幼儿辅助食品中过敏原鱼类成分

目的建立实时荧光PCR检法测定婴幼儿辅助食品中过敏原鱼类成分。方法通过改进的前处理方法,采用实时荧光PCR法,对45个样品进行检测,分别进行特异性、检出限以及适用性试验。结果用于特异性试验的18个样品中,只有鱼类出现特异性扩增;通过7个不同质量配比的鱼肉样品得出检出限低于0.01%;对市售20批样品进行检测,检测结果与样品标识相符。结论该方法快速、灵敏、准确,适用于婴幼儿辅助食品中过敏原鱼成分的检测。     

赤小豆加工食品中红豆成分定性和定量PCR检测

目的 为实现赤小豆加工食品的真伪和品质鉴别,建立赤小豆加工食品中被误用或混用的红豆成分实时荧光聚合酶链式反应（PCR）定性和微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）定量检测方法。方法 根据赤小豆和红豆基因组DNA中保守基因,分别设计适用于赤小豆和红豆成分实时荧光PCR定性检测的特异性引物探针,并设计适用于赤小豆加工食品中红豆成分双重ddPCR定量检测的通用引物探针,建立赤小豆加工食品中红豆成分质量百分比-DNA拷贝数浓度百分比线性关系式。结果 本方法对赤小豆和红豆基因组DNA检测低限分别为0.1和0.01 ng/μL,对赤小豆和红豆基因组DNA拷贝数浓度定量检测限均为6 copies/μL,可对赤小豆加工食品中质量百分比为5%~80%的红豆成分准确定量。结论 本方法可用于赤小豆加工食品中红豆成分的定性和质量百分比定量检测。     

转基因检测微流控恒温扩增芯片的研制

近年来环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）越来越多地应用于转基因农作物、微生物等的基因检测中。为了提高相关检测机构的转基因产品检测效率,加快进出口食品农产品的通关速度,本文首次使用碟式芯片环介导恒温扩增技术,在65 ℃恒温条件下,对样品中的P-CaMV35S、T-NOS、NPTⅡ、BAR、PAT、Cry1Ac、EPSPS I、EPSPS II、FMV35S和GM-HRA等转基因靶标进行同步检测,检出限可达到0.5%（m/m）,实现一次上样即可完成样品的转基因成分筛查。该方法特异性和灵敏度良好、检测时间较短,可实时读取扩增结果。对实际样品的检测结果表明,该方法的检测结果与实时荧光PCR方法的完全一致。本文开发的转基因检测微流控恒温扩增碟式芯片,可用于常见农产品（大豆、玉米、大米和棉花等）的转基因成分筛查,为转基因产品的定性检测提供了新的快速、灵敏、高通量技术平台。     

大豆粉转基因成分能力验证样品的检测分析

目的 提高实验室对转基因大豆定性检测的准确性和检测人员专业技术水平, 增强实验室竞争力。方法 通过核酸蛋白仪器分析法和单重实时荧光PCR (simplex real-time fluorescence PCR)法对样品内源基因扩增的循环阈值的影响来比较2种方法, 分析2种DNA提取试剂盒的提取质量。对标准SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》扩增反应体系中DNA模板量进行优化后, 对样品进行检测。再依据标准SN/T 1202-2010《食品中转基因植物成分定性PCR检测方法》的要求, 对样品进行检测。最后对2个标准的检测结果进行比对。结果 通过内源基因扩增循环阈值的数据确认, 更能准确反映试剂盒提取的DNA是否满足后续外源基因的分析检测要求。2种标准方法对19-N578和19-M913 2个待测样品的检测显示3种外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS均为阴性, 19-N578和19-M913待测样品均为非转基因大豆。结论 本次能力验证获得满意评价。DNA提取质量的评估, 体系中DNA模板量的优化, 检测方法的选择和实验的质量控制都是影响能力验证结果的重要因素。     

Fapas大豆粉中转基因成分检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检验人员的检验水平,扩大实验室影响力,增强竞争力。方法根据Fapas组织方提供的能力验证作业指导书及GB/T19495.4-2004《转基因产品检测核酸定性PCR检测方法》和SN/T1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》对一份100%大豆粉测试样品进行转基因成分检测。结果该批次大豆粉样品pCaMV35S、tNOS、Roundup Ready(GTS-40-3-2)品系检出转基因成分, MON89788品系未检出转基因成分。结论本次能力验证结果为满意。     

转基因水稻定性PCR检测体系的建立

采用PCR技术检测CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因,判断水稻样品中是否含转基因成分,建立了稳定快速的转基因水稻定性PCR检测体系.PCR检测的灵敏度达到0.1%,稳定性良好.结果表明:PCR技术检测外源基因是灵敏和准确的,可以广泛地应用到转基因作物及其加工产品的转基因成分检测中.此外,进一步讨论了转基因成分检测中存在的问题、转基因产品标识的必要性和目前转基因检测技术在检测中的问题.     

利用实时荧光PCR方法检测转Bt基因大米

应用实时荧光PCR技术对转基因大米进行了定性和定量检测研究.本研究以转基因B163大米为材料,采用TaqMan探针技术,对大米中的内源基因蔗糖磷酸合酶SPS和转基因水稻中普遍存在的外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子以及苏云金芽孢杆菌(Bacillusthndngiemis,简写为Bt)杀虫晶体蛋白基因Cry1Ac进行了实时荧光PCR研究,并对外源基因Cry1Ac进行了定量检测和敏感性分析.该实时荧光PCR方法检测结果和常规PCR结果一致,同时不用进行凝胶电泳,更为快速、简便,降低了污染机会,可用于转Bt基因大米的定性和定量检测.     

实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立

采用实时荧光定量PCR技术 ,通过使用特异的引物和探针 ,对大豆中的内源基因Lectin和转基因大豆中的外源基因EPSPS进行了定量检测 ,建立了Monsanto公司生产的商业化转基因大豆Roundup Ready○R的定量PCR检测方法。该方法的检测灵敏度 <0 0 1% ,是国际上设定的转基因最低限量的 10 0倍