Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

重组大肠杆菌生产人表皮生长因子的发酵条件

通过质粒转化实验,获得了较好的产hEGF重组菌,对重组菌发酵进行优化,获得最佳初始糖质量浓度为5g/L、蛋白胨20g/L、酵母抽提物10g/L、（NH4）2HPO43．5g／L、Amp100mg/L;最佳接种时间为种子液生长到5－6h,即菌体OD值在1．0－2．0;诱导剂最佳添加时间为8h,即菌体OD值在8．0左右,通过流加发酵进行高密度培养,可使重组菌的hEGF的产率达102mg/L,比优化前提高了近30％。     

枯草杆菌中性蛋白酶基因的表达

本文研究了中性蛋白酶基因在不同宿主菌及各种培养条件下的蛋白酶表达水平。用含有中性蛋白酶基因的重组质粒ＰＭＰＲ４，ＰＭＰＲ８和ＰＭＰＲ１６转化ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢＧ２０３６，ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡＳ１．３９８和ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭＬ，对转化菌产生的蛋白酶活性分析表明：三个重组质粒的导入，均使主菌的酶活性有大幅度的提高。其规律是：宿主菌的蛋白酶活性越低，提高的幅     

大肠杆菌生产重组极耐热木聚糖酶的诱导条件及其酶学性质

构建重组菌(JM109／pTre-99A-xylIV)作为极耐热木聚糖酶的生产菌株，研究了IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长的不同阶段加IPTG和温度对重组菌生产极耐热木聚糖酶的影响以及它的酶学性质．结果表明，IPTG诱导8h后极耐热木聚糖酶的表达量基本维持不变，0．5～5mmol／L浓度的IPTG诱导重组菌表达极耐热木聚糖酶的效果基本相同；当重组菌生长到OD600为1．2左右时加IPTG诱导最好，诱导温度对极耐热木聚糖酶表达水平的影响不大．重组耐热木聚糖酶的最适反应pH值为5．4～5．8，重组极耐热木聚糖酶的最适反应温度大于100℃，重组极耐热木聚糖酶在pH值4．2～7．5都比较稳定，重组极耐热木聚糖酶的温度稳定性好，在90℃下保温2h后残存酶活还有90％。     

小鼠肝脏羧酸酯酶的cDNA克隆、表达及应用

从小鼠肝脏中克隆羧酸酯酶（CES）基因家族成员Ces1f的cDNA,在大肠杆菌中表达,并验证重组酶对农药的作用。采用RT-PCR克隆Ces1f cDNA,与pUCm-T载体连接测序后,亚克隆至表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a-Ces1f,转化到宿主菌BL21（DE3）后经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定,采用Ni柱对表达产物进行纯化并测重组CES的酶比活,利用HPLC验证重组酶对不同农药的作用。结果显示：成功获得纯化的77kDa的重组CES蛋白,其酶液的比活为55.37U/mg,HPLC检测发现重组CES对西维因、呋喃丹及甲基对硫磷等具有降解作用。成功表达重组CES,其对农药具有降解作用,为环境中农药残留的降解奠定了基础。     

茂原链霉菌luxR基因对TGase生物合成的作用

前期研究表明,MgCl_2胁迫不但可以提高TGase的产量,还会影响微生物次级代谢产物合成的一个重要调节因子LuxR家族蛋白的表达.为了研究LuxR家族蛋白对茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)TGase生物合成以及菌体生长的调控作用,利用pKC1139为载体,构建luxR基因阻断质粒,通过PEG介导的质粒转化将其转入S.mobaraensis原生质体中,利用单交换同源重组法将整个重组质粒插入到茂原链霉菌基因组中构建S.mobaraensis luxR家族蛋白基因阻断突变菌.利用菌体干重法对比突变菌和野生菌菌体生长变化,利用比色法研究两株菌TGase生物合成的变化,找到LuxR家族蛋白基因表达与TGase生物合成之间的关系.结果发现,本研究采用单交换同源重组的方法可以成功地构建出S.mobaraensis luxR基因阻断突变菌株.通过对比野生菌与阻断菌株生长和TGase活力的变化发现阻断luxR基因会导致菌体生长受阻,TGase合成延迟,并且表达量显著下降.这些研究结果表明本文研究的luxR基因可能是S.mobaraensis合成TGase必不可少的正向调控因子.     

绿色荧光蛋白标记在MEOR中的应用研究

为了充分认识目的优势菌种经油藏运移后在产出水中分布的规律与数量,准确分析和客观评价MEOR现场试验效果,利用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记目的菌,通过绿色荧光蛋白跟踪监测目的菌的动态信息。构建含有GFP基因的质粒pET-30a(+)-EGFP,并将其成功导入JD中。对构建的JD(gfp)工程菌进行培养发现,该工程菌在含有Kan质量浓度50μg/mL的培养条件下,重组质粒在JD(gfp)工程菌体内传代稳定,绿色荧光的表达稳定。但是在没有选择压力的培养条件下,重组质粒在JD工程菌胞体内有丢失现象。与野生菌混合培养,JD(gfp)工程菌具有很好的配伍性和竞争性,并且不发生重组质粒的水平转移,因此在环境中释放是安全的。     

纤维素酶E5基因在E．coli中的克隆与表达

将含纤维素酶E5基因的质粒pD541用Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,经电泳分离获取含E5基因的小片段,将该片段定向插入表达质粒pSE420的多克隆位点上,进一步将重组DNA转人大肠杆菌宿主．采用刚果红染色法检测出选择性平板上的转化子具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性．摇瓶产酶试验进一步表明,基因重组后的大肠杆菌能高效表达E5基因并将产物分泌出胞外,培养液中可检测到的CM-Case活力达31．6U／mL．该研究结果为进一步构建高效纤维素分解菌株打下了良好的基础,具有重要的学术意义和实际应用价值．     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

乳酸脱氢酶A(ldha)基因的克隆与原核表达

乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶,在厌氧条件下能催化丙酮酸生成乳酸;当动物体内缺乏葡萄糖时,还可氧化乳酸生成丙酮酸并经葡萄糖异生途径转变为葡萄糖。通过反转录PCR获得了Hela细胞中的ldha基因,并将它克隆到pET28a(+)载体上,获得重组表达载体pET28a(+)-ldha。重组质粒通过转化法转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中。SDS-PAGE分析表明,在1.0 mmol·L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了一条分子质量约为36 kDa的目标蛋白。     

壳聚糖GFP质粒纳米粒对肿瘤细胞的转染效率研究

用绿色荧光蛋白（GFP）基因做报告基因，制备壳聚糖GFP质粒纳米粒，体外转染人肝癌细胞Hep G2和肺癌细胞3.549，定性评价纳米粒的转染效率和细胞毒性。结果表明壳聚糖GFP质粒纳米粒能转染两种细胞并在表达GFP，但两种细胞的转染效率不同，且该纳米粒能抑制两种细胞生长。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因的克隆与序列分析

将GenBank中已报道的罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因对已公布的嗜酸乳杆菌NCFM基因组全序列做tblast,找到一个同源编码框.参照此编码框的核苷酸序列及pQE30质粒图谱特性设计上、下游引物,利用PCR法扩增嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因,并克隆到pQE30质粒载体上进行测序.分析测序结果表明,扩增得到的目的DNA全长1 776 bp,G C含量为37.5%,共编码591个氨基酸,理论相对分子质量67.5kDa.用Signal P3.0对其N端前70个氨基酸序列进行分析,结果表明,第20~40位氨基酸有较强的疏水性.不过,N端前70个氨基酸的C值、S值和Y值并不高,最有可能的酶切位点位于第45位与第46位氨基酸之间,但预测其被切割的可能性概率低于1%.可以推断,在嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶的N端氨基酸序列中不存在信号肽序列.     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

br基因的克隆及表达

细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,BR)是嗜盐菌细胞膜上唯一的一种光能转换色素蛋白,BR以视黄醛(retinal)作辅基,在光诱导下吸收光子后会产生一系列的光循环中间体,最后又回到原始状态．由于BR这种独特的分子结构和光循环过程,及其作为一种具有光敏特性的蛋白质生物分子,可嗵过生物学技术进行改造,正引起光子学研究及生物学研究领域的高度注意．从Genbank查询br基因的全序列,然后采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,采用DNA star软件辅助设计了上下游引物,以嗜盐菌(Halobactrium Halobium)的基因组DNA为模板克隆获得了完整的细菌视紫红质基因br,并且将经测序鉴定的br基因重组到原核高效表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coli．,将阳性转化子经IPTG诱导表达获得BR与GST(谷胱苷肽转移酶)的融合蛋白后,提取蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western印迹反应,检测表达结果为阳性,且表达蛋白的大小与预想的一致．     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的亚克隆及表达

将人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。结果显示,重组酵母菌在甲醇体积分数为0.5%,72 h培养后,所提取的酶蛋白经酶活性检测,发现具有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其分子质量为52 ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。