共表达FMDV P1-2A和3C重组鸡痘病毒疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究

将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因分别插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTA-16Lac Z的复合启动子和单一启动子的下游,构建共表达重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1,与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞,经RT-PCR、IFA及Western blotting检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组鸡痘病毒株vU-TAL3CP1。并与FMDV重组核酸疫苗免疫小鼠实验表明,各实验免疫组均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应,其中以重组鸡痘病毒与核酸疫苗联合免疫效果好于其它实验各组。     

HIV-1核心蛋白Gag与IL-6共表达重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性研究

分别将IL-6和HIV-1gag基因插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTAL串联启动子和复合启动子(ATI-P7．5)下游，构建了重组鸡痘病毒表达质粒pUTA-GAG-IL6。经同源重组和Western blot检测，获得重组鸡痘病毒，并将该重组病毒免疫BALB／c小鼠，检测免疫小鼠血清抗体水平和特异性CTL杀伤活性。结果获得的重组鸡痘病毒可同时表达HIV-1核心蛋白和IL-6，并在感染细胞内形成病毒样粒子。重组病毒具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。     

一种新型双向启动子--棉花曲叶病毒启动子的分离、序列分析与功能初探

以棉花曲叶病毒(CLCuV)侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增CLCuV双向启动子片段并插入克隆载体.序列分析和同源性比较表明,克隆的启动子长436bp,与目前发现的9种CLCuV株系的启动子序列均不相同,同源性最高达99.32%.将启动子片段分别以不同方向与GUS报告基因和nos终止子融合,构建了瞬时表达载体.通过基因枪法将质粒载体导入烟草和棉花叶片细胞中进行瞬时表达,结果表明,互补链基因方向启动子属强启动子,在叶肉及维管组织均有较高的活性;病毒链基因方向启动子表达活性较低.本文初步证实分离的互补链基因启动子可作为新型强启动子应用于双子叶植物尤其棉花的遗传转化.     

共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素(AIV HA)基因串联后(拥有同一个阅读框)和鸡白细胞介素-18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子1(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

针对我国口蹄疫(FMD)流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT.该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV 2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因(其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株)作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因.将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒(FPV)表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带OAAT表达金和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDV VP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础.     

一种新型双向启动子——棉花曲叶病毒启动子的分离,序列分析与功？…

以棉花曲叶病毒（ＣＬＣｕＶ）侵染的烟草叶片组织ＤＮＡ为模板,通过聚合酶链反应扩增ＣＬＣｕＶ双向启动子片段并子片段并插入克隆载体。序列分析和同源性比较表明,克隆的启动子长４３６ｂｐ,与目前发现的９种ＣＬＣｕＶ株系的启动子序列均不相同,同源性最高达９９．３２％。将启动子片段分别以不同方向与ＧＵＳ报告基因和ｎｏｓ终止子融合,构建了瞬时表达载体。通过基因枪法将质粒载体导入烟草和棉花叶片细胞中进行瞬时表达。     

重组质粒pcFlaA在青石斑鱼肌肉中的表达研究

在哈维氏弧菌TS-628菌株鞭毛丝蛋白FlaA基因末端加上一段编码Flag短肽的核苷酸序列作为检测标记后,将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切、PCR扩增及重组质粒测序证实基因片段插入正确,将该重组质粒命名为pcFlaA.将pcFlaA以肌肉注射方式免疫青石斑鱼.免疫后第7天开始检测鞭毛丝蛋白在石斑鱼肌肉中的表达状况,之后每隔1周检测1次,共检测4次.首先采用PCR技术在DNA水平检测重组质粒转染石斑鱼肌肉细胞的情况,再以RT-PCR法在mRNA水平上检测转染质粒在鱼肌肉中的转录,最后以免疫组化染色技术在蛋白质水平上检测目的蛋白的表达.结果在DNA及mRNA水平上均可检测到目的条带,在蛋白质水平上可检测到明显阳性位点,由此证实pcFlaA可以转染石斑鱼肌肉细胞并可在其中进行表达,而且质粒在鱼体内持续表达的时间至少1个月.     

小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4 、CD8 T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.     

HIV-1中国流行株gp120基因在痘苗病毒中的表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

将HIV－1中国流行株gp120基因在痘苗病毒中进行表达,以期获得重组痘苗病毒,与核酸疫苗混合免疫,评价免疫效果,为艾滋病疫苗开发研制打下基础。将HIV－1中国流行株gp120基因片段插入到pJ38载体启动子下游,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒,SDS－PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫BALB／c小鼠,进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4＋CD8＋T细胞数目以及血清抗体等细胞免疫和体液免疫指标检测。结果获得的重组痘苗病毒vJ38pg120能够表达Gp120蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,具有良好的免疫原性,其免疫效果以2rVV-DNA混合方式为最好。重组痘苗病毒vJ38gp120。     

短发夹RNA介导RNA干涉的实验学控制研究

采用载体介导的RNA干涉(RNA interference,RNAi)技术抑制HEK293H细胞中外源报告基因的表达,并设置一系列的实验学控制以探讨其在RN加应用研究中的价值及意义。运用pAVU6 27,构建了针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的一系列短发夹RNA表达载体,并用脂质体法转染于．HEK293H细胞中,检测EGFPmRNA及蛋白表达水平。瞬时转染48h后,RT-PCR及Western blot结果表明,针对EGFP三个靶点的干涉质粒均不同程度地抑制细胞内EGFP的表达,但仅转录正反义链、链内1—2个碱基错配的干涉载体不能介导特异的RNAi效应。此外,共转染实验结果表明干涉质粒两两间无相互增强或抑制的RNAi效应。在此基础上,通过G418筛选生成了HEK293H EGFP稳定表达株,在转染后不同时间点检测EGFPmRNA及蛋白表达变化,发现RNAi效应在一定时间范围内呈现明显的时间依赖性。这些结果表明,有效的实验控制在RNAi研究中十分必要,具有重要的参考价值。基于载体表达的RNAi作用呈现明显的时间依赖性效应,为RNAi应用研究提供了一定的参考及借鉴价值。     

水稻白叶枯病菌受寄主诱导基因的鉴定

用一个具链霉素（Ｓｍ）抗性并含无启动子ＣＡＴ基因的广宿主启动子探针质粒ＰＩＪ３１００，用鸟枪法在ＣＡＴ基因上游的ＢａｍＨ１克隆位，或插入水稻白叶枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ），用ＢａｍＨ１完全酶切的染色体ＤＮＡ片段，将重组质粒转化大肠杆菌ＥＤ８７６７在含链霉素的ＬＢ单板上筛选转化子。得到容量为６０００个转化子的克隆群体，其中２％的克隆含有水稻白叶枯病菌启动子活性片段，在平板上表现氯霉素（Ｃｍ）抗性。在帮助质粒ＰＲＫ２０１３的帮助下，通过三亲支配，将含有水稻白叶枯病菌启动子片段的重组质粒转移进野生型的水稻白叶枯病菌中去，在含链霉素的ＰＳＡ平板上筛选１６００个接合子，其中一个在平板上表现氯霉素抗性及含有组成表达的水稻白叶枯病菌启动子。随机选取２００个平板上对氯霉素敏感的接合子，接种用氯霉素处理的水稻感病品种金南风，得到１５个比对照明显致病的克隆。用其中一个含受水稻特异诱导启动子的重组质粒为探针，在水稻白叶枯病菌野生菌基因文库中筛选到２７个阳性克隆。     

共表达VP3与hIL-18基因真核重组质粒的构建及对人结肠癌细胞的影响

先将鸡贫血病毒VP3基因插入真核表达载体pVAXl的多克隆位点，再将pVAX1载体上的IRES启动子及新霉素基因一同切下插入pVAXl的VP3基因下游，然后切下新霉素基因，将pIRES1基因插入其中，构建成pVVP3IL-18，将pVVP3IL-18转染Heda细胞。间接免疫荧光表明，在细胞膜和细胞浆观察到了特异的黄绿色荧光，证明表达了hIL-18。pVVP3IL-18转染人结肠癌细胞HCY-116后，经AO／EB染色及电镜观察，可见大量细胞凋亡。说明真核重组质粒pVVP3IL-18可在HeLa细胞中表达，并可在体外诱导人结肠癌细胞HCT-116凋亡。     

真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的体外重组与纯化研究

将真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域克隆到表达载体pQE30中,并转化到大肠杆菌XL-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选,并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后,进行序列测定。序列测定结果显示,该基因结构正确,且准确插入到表达载体启动子的下游,获得了结构和组成正确的重组子。重、组子经IPTG诱导后,以SDS-PAGE电泳鉴定,电泳结果表明,该基因在大肠杆菌XL-blue中实现了表达。通过对诱导条件的调整,在体外获得了高效表达的重组蛋白,高效表达的重组蛋白约占菌体蛋白的25％-30％。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示,随诱导时间的增加,重组蛋白产量逐渐增高,经4h诱导,其表达量可以达到平台期,过长时间的诱导,对表达产量没有影响。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化,获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法,用Sephadex G150,对重组蛋白进行脱盐复性,使重组蛋白得到了进一步纯化。     

部分缺失的棉花曲叶病毒互补链基因启动子具有超强活性

棉花曲叶病毒（CLCuV)互补链基因启动子是一种新近鉴定的启动子,它能驱动外源基因在植物体内高效表达,为了研究其最佳启动子区域,对启动子5端进行了一系列缺失,得到5种不同长度的启动子片段与GUS基因融合的植物表达载体,继而导入根癌农杆菌,采用叶盘法转化烟草,并检测转基因植株的GUS活性,实验结果表明,自启动子5端缺失至翻译起始位点上游－287,－271时启动子活性分别是全长启动子的5倍,3倍。首次对棉花曲叶病毒互补链基因启动子的功能区进行了分析比较,发现缺失负调控元件的启动子比全长启动子具有更强的活性,平均活性是CaMV35S启动子的12倍,暗示该启动子具有应用潜力。     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

WSSV-VAP1基因克隆及在毕赤酵母中的表达

根据WSSV-黏附蛋白(VAP1)基因序列设计了一对引物,在5‘引物和3‘引物中分别引入EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增,将VAP1基因克隆至穿梭载体pGAPZαA之GAP启动子下游位点,构建成含α-factor信号肽的重组表达载体,获得的重组质粒pGAPZαA-VAP1经线性化后转入毕赤氏酵母SMD1168菌株,构建成分泌型表达VAP1的酵母工程菌株。SDS-PAGE和Western-blot及结合活性检测分析表明,VAP1基因在该体系中得到成功表达,表达产物与对虾细胞膜具明显的结合活性。     

动物乳腺组织高效表达通用型YAC载体的构建

以含有人α-乳白蛋白基因功能域的YAC(yeast artificial chromosome)为起始材料,构建了可以在动物乳腺高效表达外源基因的载体系统。根据已发表的人α-乳白蛋白基因序列,通过PCR的方法,扩增出了其5’端的837bp及3’端的1007bp片段,构建了整合型载体pRLA22。利用pRLA22在大肠杆菌中进行基因操作,可以将外源基因准确地置于乳白蛋白基因启动子控制之下。把重组的pRLA22导入含YAC的酵母菌后,高频率同源重组事件将会把外源基因插入YAC。本实验通过上述程序,将鸡的γ-干扰素基因cDNA序列导入了YAC。经过PCR检测,证明鸡的γ-干扰素cDNA序列已被重组到YAC的预定位置。因此,大肠杆菌载体pRLA22和含人的α-乳白蛋白基因的YAC,将构成能在动物乳腺高表达外源基因的有效载体系统。     

乙肝表面抗原S2S基因在蓝藻Synechococcus sp.PCC7942中的表达研究

用PCR法将乙肝表面抗原基因S2S片段从乙肝病毒中扩增得到,将其插入到蓝藻热休克表达载体pEUTMT1中,构建成表达重组质粒pES2ST1.将蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的总染色体与质粒pES2ST1同时进行EcoRI和SacI双酶切,再连接构建成为系列含有蓝藻染色体DNA同源片段的供体表达质粒.经转化筛选得到蓝藻Synechococcus sp.PCC7942转化藻株.PCR和Southern 杂交证明目的基因已经整合到宿主的染色体中.转化藻通过热诱导后,Northern-blot结果呈阳性,用化学发光检测技术可以检测到微量目的蛋白的表达,检测含量约为0.78～0.64ng/ml,目的蛋白约为可溶性蛋白的1.1×10-6～1.5×10-6.     

人免疫缺陷病毒I型p24gag基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。     

人骨形态发生蛋白－1（hBMP－1）成熟肽的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ方法从ＢＭＰ－１的ｃＤＮＡ中克隆了ＢＭＰ－１成熟肽的编码基因，删除了ＢＭＰ－１前体分子Ｎ端的信号肽序列和Ｃ端的其他序列。用ＨｉｎｄⅢ消化１．３Ｋｂ的ＰＣＲ产物，将０．８４和０．４６Ｋｂ两片段分别克隆到ｐＵＣ载体中进ＤＮＡ序列分析。分别酶切回收ＥｃｏＲ－ＨｉｎｄⅢ和ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ两目的基因片段，与大肠杆菌表达载体ｐＢＶ－２２０进行退火连接，使插入基因受控于Ｐ＿ＲＰ＿Ｌ启动子。将含有ＢＭＰ－１成熟肽编码基因重组表达质粒ｐＢＶＢＭＰ－１转化大肠杆菌宿主细胞进行温度诱导表达。结果表明，经４２℃热诱导后，大肠杆菌能以包涵体形式表达ＢＭＰ－１成熟肽，其分子量约为５２ｋＤａ。