农药核酸适配体筛选及应用的研究进展

核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术在体外筛选到的单链寡核苷酸,与靶标具有高亲和力和特异性,且稳定性好,易于合成和修饰,被认为是生物传感器的理想识别元件之一,在农药残留快速检测应用中表现出极大的潜力。近年来,SELEX技术在农药适配体筛选方面不断发展,目前已筛选获得多种农药适配体,并且通过诸多方法研究所筛选的适配体与农药分子的结合机理,为适配体在农药残留快速检测的进一步应用提供参考依据。本文概括和总结了以农药为靶标的适配体筛选方法、农药分子与适配体的结合机理,并简要总结了以适配体为识别元件的生物传感器在农药残留快速检测中的应用。     

核酸适配体在食源性致病菌检测中应用的研究进展

核酸适配体(aptamer)是经体外筛选可特异性识别并结合靶分子的寡核苷酸片段(单链DNA/RNA序列),具有高特异性、高灵敏度、高亲和力及易于修饰等优点,已在食源性致病菌检测领域得到应用。本文主要对核酸适配体筛选技术分类以及纳米金适配体技术、荧光适配体技术、电化学适配体技术、流式细胞适配体技术和表面增强拉曼适配体技术在食源性致病菌检测中的应用作简要综述。     

适配体在食品中有害小分子检测领域应用的研究进展

适配体是与靶标具有高亲和力及选择性结合能力的单链寡核苷酸,可通过指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)筛选得到。SELEX技术可选择的靶分子范围十分广泛,包含蛋白质、多肽、核苷酸、染料、氨基酸、金属离子、生物毒素等;经SELEX技术筛选出的适配体具有特异性强的特点;同时该技术具有周期短的优点;筛选用的文库化学合成即可,避免了动物实验。食品中有害小分子主要包括真菌毒素、农药、兽药、金属子、违禁添加物等,主要存在于粮食、谷物、饲料、各类食品、水中。这些有害小分子通过食物链进入人及动物体内,严重威胁到其健康。目前已有不少文献报道了以适配体作为识别元件,用于食品安全、环境检测及生物医药等领域的多种高亲和力及特异性的传感器和检测方法的建立。本文主要介绍了近年小分子适配体在食品安全检测中应用的研究进展。     

适配体及其研究进展

综述了适配体的筛选方法以及近几年来在分析检测、食品安全、临床医疗等领域的应用。适配体是一类能与靶分子高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸单链。它可以通过指数级富集的配体进化技术(SELEX)从体外筛选而得。适配体类似于抗体而优于抗体,愈渐成为各种研究项目、检测方面等的重要课题之一。     

基于适配体的沙门氏菌检测方法研究进展

沙门氏菌(Salmonella)是重要的食源性致病菌,能引起人和动物中毒并引起多种严重的疾病,对人类健康造成了巨大危害,因此建立简单高效的检测方法是预防和控制沙门氏菌疾病的关键。适配体(aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)从构建的随机文库中筛选得到一段对靶标物质具有高度亲和力和特异性的寡核苷酸序列,多种食品致病菌的适配体已被成功筛选并广泛应用于食品中致病菌的检测。本文对当前沙门氏菌检测技术进行简单论述,重点介绍了基于适配体的沙门氏菌检测方法,对各种方法的优势和缺点进行了比较和总结,并论述了适配体的发展及应用。     

赭曲霉毒素A核酸适配体筛选

目的筛选小麦和其他相关食品中常见的赭曲霉毒素A真菌毒素核酸适配体。方法采用固态靶标筛选策略和磁分离的筛选方法筛选赭曲霉毒素A的核酸适配体。结果获得的赭曲霉毒素A核酸适配体亲和力较高,解离常数为纳摩尔级;特异性好,与赭曲霉毒素A结构相似性化合物如赭曲霉毒素B、N-乙酰苯丙氨酸或华法令不结合或结合力非常弱。结论本文采用固态靶标筛选策略和磁分离的SELEX筛选方法获得了赭曲霉毒素A的高特异性、高亲和力核酸适配体,有望在农产品质量安全领域替代传统抗体开发真菌毒素快速检测传感器或制备固相亲和柱。     

肠致病性大肠杆菌适配体筛选研究

目的食源性致病菌引起的食源性疾病已成为全球食品安全面临的巨大威胁,其中由大肠杆菌引起的食源性疾病最为常见。因此发展快速、准确检测大肠杆菌的方法对于保障食品安全、保护国民健康具有重要意义。方法应用Whole bacteria-SELEX(指数富集的配体系统进化技术),以肠致病性大肠杆菌为靶标,经过15轮的筛选富集,将所得产物进行克隆测序,并结合荧光分析考察所得序列的亲和力和特异性,根据解离常数值分析比较序列的亲和力和特异性,最终得到2条(Seq.1和Seq.28)与肠致病性大肠杆菌高特异性结合的适配体。结果适配体Seq.1和Seq.28均对肠致病性大肠杆菌表现出了相对良好的亲和力和特异性(对其他菌的相对亲和力均低于15%),解离常数分别为45.06±6.797和32.31±6.002 nmol/L。结论本文利用SELEX技术筛选特异性识别肠致病性大肠杆菌适配体,具有稳定性高、合成方便、易标记等特点,可进一步应用于食品中肠致病性大肠杆菌的快速检测。     

福氏志贺菌核酸适配体的SELEX筛选及特异性研究

为探究核酸适配体技术在食源性致病菌检测和鉴定方面的应用,以福氏志贺菌为研究对象,采用全细胞SELEX技术筛选与其特异性结合的适配体。经多轮正筛和反筛,共克隆得到17条序列,4条高频适配体(F-1、F-3、F-9和F-16)对福氏志贺菌有较高的亲和力,其中F-1和F-9与福氏志贺菌的亲和力较高,相应的亲和常数Kd值分别为(51.3±3.25) nmol/L和(42.6±7.11) nmol/L。软件模拟F1和F9的二级结构,其最小自由能分别为-7.39 kcal/mol和-6.98 kcal/mol。本文首次筛选出对福氏志贺菌具有较高亲和特异性的适配体,为后续利用适配体进行食源性致病菌快速检测奠定了基础。     

赭曲霉毒素A的适配体筛选

目 的 筛选小麦和其他相关食品中常见的赭曲霉毒素A真菌毒素核酸适配体。方 法 采用固态靶标筛选策略和磁分离的筛选方法筛选赭曲霉毒素A的核酸适配体。结 果 获得的赭曲霉毒素A核酸适配体亲和力较高,解离常数为纳摩尔级;特异性好,与赭曲霉毒素A结构相似性化合物如赭曲霉毒素B、N-乙酰苯丙氨酸或华法令不结合或结合力非常弱。结 论 本文采用固态靶标筛选策略和磁分离的SELEX筛选方法获得了赭曲霉毒素A的高特异性,高亲和力核酸适配体,有望在农产品质量安全领域替代传统抗体开发真菌毒素快速检测传感器或制备固相亲和柱。     

指数富集的配体系统进化技术研究进展及在食品检测中的应用

核酸适配体是指能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的寡核苷酸序列,可识别的靶分子范围非常广,并均可通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到。近年来,在传统SELEX技术的基础上,新的SELEX技术不断出现。这些新技术的出现,在不断完善SELEX技术的同时,也极大地推动了适配体技术在各学科领域中的发展及应用。本文对核酸适配体的筛选方法进行了总结,并介绍了其在食品检测领域的应用现状和发展方向,为核酸适配体的筛选与应用提供了参考。     

氧化石墨烯指数富集法筛选食品中的组胺适配体

组胺(HA)是影响人类健康和食品质量的重要生化物质。对其进行快速、准确检测和鉴定至关重要。本试验利用氧化石墨烯对单链寡核苷酸(ssDNA)的强吸附作用,分离与靶标结合和未结合的ssDNA,对组胺适配体进行11轮的体外指数富集筛选,最终得到15条高亲和力和特异性的适配体。通过后续的适配体二级结构、亲和性和特异性分析,HAA-4和HAA-7被确定为最佳候选适配体,可被作为将来关于组胺的新型检测方法构建的候选适配体。本文首次利用氧化石墨烯指数富集(GO-SELEX)技术筛选出对组胺具有较高亲和特异性的适配体,为后续利用适配体对食品中组胺快速检测奠定了基础。     

Capture-SELEX技术筛选β-苯乙胺核酸适配体

利用指数富集配体的系统进化技术(SELEX)中基于固定ssDNA文库的捕获SELEX(Capture-SELEX)技术,筛选能特异性识别β-苯乙胺的核酸适配体。通过在Capture-SELEX技术中结合熔解曲线监测ssDNA文库的富集,并经过氧化石墨烯(GO)荧光法验证候选适配体的亲和力和特异性,证实获得一条特异性识别β-苯乙胺的适配体(PHE-2),解离常数(Kd)为(71.64±11.47)nmol/L。该适配体为β-苯乙胺的分析检测提供了新的分子识别元件。     

全细胞SELEX法筛选单增李斯特菌的ssDNA适配体

以单增李斯特菌活细胞为靶标,采用指数富集配基的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从含40个随机碱基序列的单链DNA(single-stranded DNA,ss DNA)文库中筛选与之特异性结合的适配体。酶联配体吸附法(ELASA)测定筛选过程中次级文库与单增李斯特菌结合力的变化。对筛选得到的适配体进行序列测定,RNA structure软件预测二级结构,ELASA测定适配体与靶标的结合能力和特异性。结果显示,每轮筛选后次级文库与靶标的亲和力增强,特异性适配体逐步得到富集。测序获得23条适配体,其序列同源性不高,但预测的二级结构有些相似,根据二级结构将其分为3个群,分析结果表明二级结构与适配体的亲和力有关。挑选亲和力较强的21号(Lma-21)和35号(Lma-35)适配体能特异性地识别单增李斯特菌。本研究为开发食源性病原菌单增李斯特菌的新型检测试剂提供了基础材料。     

应用SELEX技术筛选沙门氏菌抗原的适配子

目的:应用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选沙门氏菌抗原的高亲和性适配子。方法:首先合成一个全长78个核苷酸中间含35个随机序列的随机单链寡核苷酸序列(ssDNA)文库,再以环氧乙烷丙烯酸珠子作为筛选介质,利用生物素-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与沙门氏菌抗原的亲和力,以获得沙门氏菌抗原的高亲和性适配子。结果:随着筛选轮数的增加,DNA适配子与沙门氏菌抗原结合后显色,吸光度逐渐增加,初步获得了沙门氏菌抗原的高亲和性适配子。结论:实验所用的筛选流程是适当的,可以考虑推广用于类似靶目标的筛选。     

适配体结合量子点技术同时检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7方法

目的：基于适配体结合量子点技术,建立一种同时针对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7两种食源性致病菌快速高效、灵敏的检测方法。方法：利用表面增强拉曼光谱技术筛选出与目标菌结合特异性较好的2?种适配体;利用免疫磁珠与适配体偶联技术特异性捕获2?种目标菌;选取不同发光原理的2?种量子点,并结合量子点荧光标记技术构建“磁珠＋目标菌＋量子点”的“三明治结构”,通过对结构条件优化确定2?种目标菌的检出限,并应用到市售无菌牛乳实际样品中进行加标回收率实验。结果：本研究证明所选取的2?条适配体与目标菌的结合具有高特异性,可实现对2?种目标菌的同时检测。对“三明治结构”优化结果表明：2?种目标菌的最佳捕获条件为免疫捕获时间45?min、磁分离时间2?min;适配体最适浓度为400?nmol/L;金黄色葡萄球菌检出限为101?CFU/mL,线性方程为Y=28.51X＋126.67（R2=0.973）;大肠埃希氏菌O157:H7检出限均为102?CFU/mL,线性方程为Y=92.86X－64.67（R2=0.987）,其中,Y为荧光强度,X为细菌菌落数的对数值,拟合度良好。且在牛乳样品中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7回收率分别为94.6%～102.8%和93.4%～100.4%。结论：本研究所建立的方法能够实现同时对2?种食源性致病菌快速、高效检测,该方法易操作且灵敏度高,在食品加工生产安全检测方面具有良好的应用前景。