耐高温β-甘露聚糖酶基因的高效表达与水解魔芋精粉条件的优化

β-1,4-D-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)能够随机催化水解甘露聚糖和葡甘露聚糖等中的β-1,4-甘露聚糖苷键。魔芋(Amorphophallus konjac)精粉是葡甘露聚糖类物质,以之为原粉在甘露聚糖酶的作用下可制作益生元类低聚甘露糖。采用串联多拷贝表达盒的方式提高耐高温甘露聚糖酶的表达量,获得具有高产特性的菌株;探究甘露聚糖酶的酶学性质以及水解魔芋精粉制作低聚甘露糖的最适条件,为甘露聚糖酶的产业化及低聚甘露糖的酶法制备奠定基础。结果表明:该酶的最适温度为70℃,最适p H5.0;所获得的多拷贝菌株在14 L发酵罐下酶活可达10810 U/m L;在最适反应条件下,该酶可高效地将魔芋精粉水解为低聚甘露糖。     

高产β-甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究

通过初筛和复筛从魔芋种植基地土壤样品中分离筛选高产β-甘露聚糖酶菌株。通过形态学观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,并对其产β-甘露聚糖酶酶学性质进行研究。结果表明,筛选出一株高产β-甘露聚糖酶的菌株,编号为HTGC-10,被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株HTGC-10在30 ℃、180 r/min条件下液体发酵24 h后,发酵液β-甘露聚糖酶活力为61.75 U/mL。酶学性质的研究结果表明,该菌株所产酶的最适反应pH值为6.0,在中性偏酸环境下稳定性较好,属于偏酸性酶;最适反应温度为55 ℃,热稳定性相对较差;乙二胺四乙酸（EDTA）和金属离子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+对酶活力均有不同程度的抑制作用,其中Cu2+对酶活力的抑制作用最显著。     

新型β-甘露聚糖酶制备葡甘寡糖工艺优化

为探索能应用于葡甘寡糖制备的新型β-甘露聚糖酶,利用半纤维素降解高效菌株Bacillus subtilis BE-91高产的β-甘露聚糖酶水解魔芋胶(纯度95%)。在单因素试验的基础上,采用四因素三水平的正交试验优化魔芋胶酶解工艺条件,薄层层析法定性分析酶解产物。结果表明:正交试验的最佳酶解工艺组合为魔芋胶质量浓度0.33 g/100 m L、加酶量6 U/g、酶解时间1 h、酶解温度60℃,在该条件下魔芋胶水解率为35.96%;β-甘露聚糖酶水解魔芋胶产物为二糖以上的寡糖,且主要介于二糖与六糖之间。该新型β-甘露聚糖酶用于葡甘寡糖制备,其工艺具有加酶量少、酶解时间短、产品纯度高等优势,在功能性食品制备方面具有广阔的应用前景。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达及重组酶性质研究

为实现对魔芋葡甘聚糖具有高度专一性的β-甘露聚糖酶基因的异源表达,从枯草芽孢杆菌G1中克隆出β-甘露聚糖酶基因BsmanA,将该基因与表达载体pACYCDuet-1连接并转化到E.coil BL21(DE3)中。结果表明:该β-甘露聚糖酶基因BsmanA序列全长为1098 bp,编码366个氨基酸;经Ni柱亲和层析纯化后,测得重组酶分子量大小为38 kD;酶学性质研究结果显示:该酶促反应的最适温度为60℃,最适pH为6.5,在温度50~70℃间,pH4.5~7.0的范围内能保持较好的稳定性。本研究实现了β-甘露聚糖酶的异源表达,为生物催化制备低聚甘露糖的工业化提供了新的选择。     

碳氮源对枯草芽孢杆菌发酵产β-甘露聚糖酶的影响

为提高枯草芽孢杆菌产甘露聚糖酶的能力,对Bacillus subtilis YH12产β-甘露聚糖酶的培养基组分和培养条件进行了优化,重点考察了碳氮源对发酵产酶的影响。实验结果表明,以魔芋精粉和甘露寡糖作为碳源时能对菌株发酵产酶起到良好的诱导作用,魔芋甘露寡糖的诱导效果要优于魔芋精粉,从经济效益角度考虑选择魔芋精粉作为碳源和诱导底物;以胰蛋白胨作为发酵氮源时产酶效果最佳。研究同时发现,产酶的最佳碳氮比为2:1;Na~+、K~+和Mg~(2+)对酶活具有显著促进作用;对发酵条件的考察结果显示,选择初始pH和培养温度分别为7.5和30℃时产酶效果最好。产酶发酵过程及SDS-PAGE分析表明,发酵33 h时产酶量达到最高。在此条件下B.subtilis YH12发酵产酶高峰期β-甘露聚糖酶活力达到280 U/mL,相比初始水平提高约5倍。     

β-甘露聚糖酶产生菌的筛选及魔芋低聚糖制备工艺的研究

以魔芋粉为唯一碳源,从种植魔芋土壤中定向筛选一株高产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,进行形态观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定,并研究了该β-甘露聚糖酶水解魔芋胶制备魔芋低聚糖的工艺。结果表明,筛选出一株高产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,编号为G1,被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。确定魔芋低聚糖制备的酶解条件为酶添加量50 U/g魔芋葡甘聚糖（KGM）,酶解pH值 6.5,酶解温度55 ℃;当KGM质量浓度为10 g/L,酶解时间2 h时,还原糖转化率为51.6%;当KGM质量浓度为30 g/L,酶解时间4 h时,还原糖转化率仍可达到46.9%,表明该酶具有较高的催化效率。利用薄层层析（TLC）定性分析酶解产物主要为三糖及三糖以上的低聚糖。该研究为实现酶法制备魔芋低聚糖的工业化生产奠定了基础。     

β-甘露聚糖酶制备魔芋葡甘露低聚糖的研究

利用黑曲霉菌株(Aspergillus niger)LW-1所产酸性β-甘露聚糖酶,对魔芋胶进行水解制备(魔芋)葡甘露低聚糖。酶解的工艺条件为:魔芋胶浓度150g/L,加酶量50IU/g(魔芋胶),酶解温度50℃,酶解时间6h。所获酶解产物经薄板层析和HPLC检测,主要为低聚糖以及少量单糖。再利用酵母发酵法去除其中的可发酵性单糖,最终产物为100%的(魔芋)葡甘露低聚糖。     

产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用

将产黄青霉（Penicillium chrysogenum）来源的β-甘露聚糖酶（PcMan26A）在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵,发酵液酶活力达25 200 U/mL。该酶属于GH26家族,与黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶同源性最高（67.8%）,是一个新型β-甘露聚糖酶。PcMan26A的最适催化条件为pH 6.0和50?℃,在pH?4.0～8.0和45?℃下具有良好的稳定性。该酶对魔芋粉具有最高的比活力,为3?581.0?U/mg。进一步利用该酶水解魔芋粉得到魔芋甘露寡糖,产品得率为86.2%;经分析,其主要组分为聚合度大于4的甘露寡糖。该β-甘露聚糖酶适用于生产魔芋甘露寡糖,为魔芋甘露寡糖的酶法生产提供了更多的选择。     

嗜热甘露聚糖酶manBK基因密码子优化表达及在魔芋聚糖降解中的应用

依据密码子偏好性原则,对嗜热甘露聚糖酶manBK基因密码子进行优化,以提高嗜热甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达量;并通过对该酶酶学性质的探究,探讨金属离子对酶稳定性影响及其在酶解魔芋甘露聚糖中的应用潜力。结果表明:嗜热甘露聚糖酶manBK基因优化后GC含量为40%～53%,平均值为47%,密码子适应指数(codon adaptationindex,CAI)为0.87,共有242个碱基进行优化,优化前后基因序列的一致性为76%。重组菌株在25℃条件下,诱导72 h发酵液中酶活力可达22 U/mL。甘露聚糖酶ManBK的最适反应温度为80℃,最适pH值为5.0,表观分子质量为45 kDa,动力学参数K_m值为1.40 mg/mL,V_(max)值为149.25μmol/(min·mg)。金属离子Fe3+、Ca~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)对该酶活性有促进作用,分别使酶活力提高了32%、52%、23%和459%,而金属离子K~+、Li~+、Mn~(2+)和Cu~(2+)对ManBK酶有不同程度的抑制作用。进一步分析发现,Zn~(2+)能提高该酶的热稳定性,使70℃条件下的半衰期延长了116 min。当酶底比为1∶1时,反应温度70℃,pH 5.0反应进行1.5 h,魔芋聚糖即可达到较合适的酶解,魔芋聚糖降解物的抗氧化性能增强了5.6倍左右,ManBK酶在魔芋聚糖降解中具有极强的应用潜力。本研究为ManBK酶的制备及在魔芋深加工行业中的应用提供了一定的理论支撑。     

枯草芽孢杆菌05表达β-甘露聚糖酶酶学性质的初步研究

从池塘淤泥中分离筛选出1株高产β-甘露聚糖酶的菌株(B. subtilis05),并对其酶学性质进行了初步研究。结果表明:酶最适温度为50℃;在4-45℃活性较稳定;β-甘露聚糖酶最适反应的酸碱度为pH8.0;Na+,K+显著地促进酶活性,NH4-抑制酶活性,Mg2+、Cu2+、Fe2+显著抑制酶活,Fe3+抑制最显著;培养10.5h后,发酵培养基的黏度为2.78Pa.s,12h后的黏度为1.55Pa.s。     

产甘露聚糖酶海洋微生物的筛选及酶学性质研究

目的:筛选产甘露聚糖酶的海洋微生物。方法:采用2216E、海水-高氏一号和海水-PDA培养基对采集的微生物进行分离纯化,采用平板透明圈法对菌株进行初筛,并对初筛中HC值较大的菌株通过发酵测酶活复筛;采用16S r DNA序列分析,并结合细胞和菌落形态观察及部分生理生化试验,对菌株进行鉴定;利用硫酸铵盐析法制备粗酶液,研究甘露聚糖酶作用的酶学特性。结果:从台湾海峡采集的海水和海泥样品中,分离得到细菌467株,霉菌145株,放线菌10株,初筛得到64株有透明圈的菌株,复筛得到菌株B555,其酶活力最高为28.18 U/m L,经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。菌株B555所产甘露聚糖酶的最适反应p H为7.0,且在p H 5.0~10.0时较稳定;最适反应温度为50~55℃,在55℃时半衰期约为150 min;1 mmol/L的金属离子Ni+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、K+、Fe3+、Ba2对酶活力均有抑制作用。在55℃,p H 7.0条件下,该酶对槐豆胶和魔芋粉有很好的底物特异性,Km值分别为4.7和3.33 mg/m L,Vmax值分别为588.23和476.19μmol/(m L·min)。可应用于魔芋甘露低聚糖的酶法制备。     

魔芋葡甘露聚糖的酶水解工艺条件

研究了利用黑曲霉(Aspergillus niger)E-56菌株所产高活力β-甘露聚糖酶水解魔芋葡甘露聚糖的工艺条件.在单因素试验的基础上,进一步通过正交试验确定酶法制备甘露低聚糖的最佳工艺条件为:魔芋胶质量浓度240 g/L(去离子水配制),加酶量为120 U/g,50 ℃酶解8 h.在该工艺条件下,酶解液中葡甘露低聚糖的平均聚合度(DP)在1.8～1.9范围内.     

β-甘露聚糖酶作用魔芋胶条件研究

利用枯草芽孢杆菌产生的胞外β-甘露聚糖酶水解魔芋胶,探讨单因素的影响作用,并用均匀设计考察多因素的影响作用。经二次多元回归分析,得出影响的最显著因子为时间;其次为魔芋胶浓度和温度;影响最小的因子为酶量。     

产耐热β-半乳糖苷酶蜜源芽孢杆菌的鉴定及酶学性质

从分离自蜂蜜的芽孢杆菌中筛选到一株高产β-半乳糖苷酶的菌株,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),并命名为Bacillus licheniformis SYBC hb15。纯化该酶并研究其酶学性质,以邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,B. licheniformis SYBC hb15所产β-半乳糖苷酶的最适水解反应温度是60℃;70℃放置60 min后酶活力仍保留65%,具有较高的热稳定性;与嗜热菌Talaromyces thermophilus来源的β-半乳糖苷酶相比,葡萄糖对其水解活性的抑制较弱。因此,B. licheniformis SYBC hb15所产的β-半乳糖苷酶具有较高的热稳定性和葡萄糖耐受性,有很好的工业应用潜力。     

产β-甘露聚糖酶的海洋微生物的筛选

以含有2%的NaCl培养基,从海泥、海水样品中用魔芋精粉为碳源,富集和分离产β-甘露聚糖酶的菌株,再经过平板水解圈初筛和发酵复筛得到稳定高产β-甘露聚糖酶的菌株L1。L1菌株的最佳生长条件包括:种龄12h、温度30℃,摇瓶装液量为100mL(250mL三角瓶),接种量为2%,摇床转速为160r/min,培养时间24h,β-甘露聚糖酶活力达到34.31U/mL。     

β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究

从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,其中DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达3.85U/mL。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为37℃,最适pH为6.0,pH稳定范围为5.0～9.0,在低于40℃的温度下基本稳定。Fe2+、Cu2+、EDTA和NH4+对该酶有抑制作用,Na+则有激活作用。     

β-甘露聚糖酶高产菌株的双重诱变育种

以实验室保藏的一株β-甘露聚糖酶产生菌黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1为原始出发菌株,采用自然分离、微波与甲基磺酸乙酯(EMS)双重诱变,经平皿透明圈粗筛、摇瓶初筛和复筛以及斜面传代稳定性实验,获得了一株高产、稳产β-甘露聚糖酶的突变株WS-2007。结果表明,该突变株摇瓶液体发酵产β-甘露聚糖酶活性高达3261U/mL,为原始出发菌株(1027U/mL)的3.18倍。     

产壳聚糖酶海洋Paenibacillus chitinolyticus CLT08的鉴定及酶学性质研究

目前用于制备壳寡糖的壳聚糖酶具有酶活性较低、酸稳定性较差等问题。本研究从连云港海州湾泥样中筛选产壳聚糖酶菌株,并对菌株进行鉴定、酸稳定性和酶学性质研究。结果表明,通过平板透明圈初筛和摇瓶发酵复筛,获得酸稳定性较好的壳聚糖酶产生菌株CLT08,随后利用形态学特征、生理生化测定及16S rDNA序列扩增与分析,鉴定菌CLT08为Paenibacillus chitinolyticus。菌株CLT08产壳聚糖酶最适温度为45 ℃,最适pH为4.0;Zn2+对酶有显著的激活作用,对Ba2+、Co2+、Fe2+有显著抑制作用。壳聚糖经CLT08壳聚糖酶水解后其聚合度≥6。此研究结果为该酶的进一步研究奠定了基础。     

β-甘露聚糖酶低限度水解制备适度黏度魔芋胶

利用β-甘露聚糖酶对魔芋精粉进行低限度水解,得到适度黏度的魔芋胶,改善了市售魔芋胶黏度过大在食品工业生产中不易操作的缺陷,并实现魔芋胶产品标准化。确定酶解的最适条件为:温度55℃,魔芋胶质量分数12%(去离子水配制),加酶量为3.0U/g,酶解时间120 min。在该工艺条件下得到魔芋胶的黏度在1 800～2000 mPa.s,分子量在105～107范围内的分布为91.01%,仍为大分子多糖,此水解为低限度水解。     

酶法制备甘露低聚糖

利用枯草芽孢杆菌产生的碱性甘露聚糖酶,以魔芋、槐豆胶、瓜尔胶与田菁胶为原料,制备甘露低聚糖。比较了酶对底物水解反应动力学,对低聚糖制备过程中的水解液进行了还原糖测定,并通过质谱对最终酶解液组分进行分析。结果表明:魔芋与槐豆胶为甘露聚糖酶的最适水解底物,水解8h后,还原糖得率稳定,可作为甘露低聚糖生产的指导依据。酶解24h后,魔芋、槐豆胶、瓜尔豆胶及田菁胶的主要产物分别为二糖至九糖、五糖至十糖、二糖至十糖和二糖至十糖。利用酶法生产甘露低聚糖的方法具有水解过程简单、产物聚合度低、纯度高的优点。