牦牛乳硬质干酪苦味肽RK7的抗氧化活性及其机制

目的:研究从牦牛乳硬质干酪中鉴定出苦味肽RK7的抗氧化活性及其机制。方法:运用生物信息学方法计算和分析RK7的理化和生物学特性,采用固相合成技术体外人工合成RK7并测定其抗氧化活性。借助分子对接工具,基于长寿酶家族sirtuins(SIRT1-7)和单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)介导的信号通路,研究RK7的抗氧化机制。结果:RK7的不稳定性指数为19.84;疏水性为42.86%;生物活性评分为0.404;小肠吸收能力(HIA)为0.9072+;血脑屏障穿透能力(BBB)为0.9701-;急性口腔毒性为0.6259;合成纯度为99.579%;当肽质量浓度在0.2～1.0 mg/mL范围内变化时,DPPH自由基清除率为12.26%～53.78%,ABTS自由基清除率为80.86%～87.86%;RK7与NAD+降解酶(3DZK)和胞质接头蛋白(2FLU)分别形成6个和5个氢键,3DZK的氨基酸残基Arg140、Asp147和2FLU的氨基酸残基Ser390、Asp394是其与RK7结合的重要活性位点。RK7和GSSH与3DZK和2FLU的结合表现出相似的分子机制,分别结合于3DZK的Site 1区域(X:-11.93,Y:-1.30,Z:0.38,R:10 ?魡)和2FLU的Site 2区域(X:8.33,Y:13.99,Z:20.41,R:9 ?魡)。研究结果为从分子水平分析、解释RK7的抗氧化性提供科学依据。     

牦牛乳干酪苦味肽ACE抑制活性表征的分子机制

用生物信息学方法计算并分析牦牛乳硬质干酪中鉴定出的3种苦味肽RK7、VN10和SN12的理化特性，对肽结构做能量最小化处理，从PDB数据库获取血管紧张素转化酶(ACE)蛋白晶体的X射线衍射三维结构，通过分子对接和数据库比对评估和表征苦味肽的ACE抑制活性及其与ACE的作用机理。通过计算得出RK7、VN10和SN12的不稳定性指数分别为19.84，49.44和42.87，疏水性分别为42.86%，70.00%和66.67%。分子对接结果表明:ACE分子中的Ala356、His387、Phe391、Pro407、His410、Glu411、Ser517、Val518、Pro519残基为其与RK7和VN10结合的重要活性位点，RK7、VN10和SN12分别与ACE活性位点的氨基酸形成3，2个和0个氢键；RK7、VN10和SN12与ACE的结合表现出相似的分子机制，均结合于ACE的活性空腔内(X:35.46，Y:43.15，Z:55.47，R:9 ?魡)；RK7、VN10和SN12与BIOPEP数据库中已知ACE抑制肽的最高相似度分别为57.14%，90.00%和75.00%。综合RK7、VN10和SN12与ACE活性位点氨基酸残基相互作用的情况和BIOPEP数据库比对结果预测出3种肽段的ACE抑制活性:VN10 > RK7 > SN12。本试验为理论层面和分子水平研究干酪苦味肽的ACE抑制活性提供参考。     

基于计算机虚拟技术研究牦牛乳硬质干酪苦味肽的抑菌活性差异

为研究牦牛乳硬质干酪中苦味肽的抑菌活性差异及其与不同微生物菌体蛋白相互作用的氨基酸和位置信息。运用生物信息学方法计算牦牛乳硬质干酪中4种苦味肽RPKHPIK（RK7）、TPVVVPPFL（TL9）、VYPFPGPIPN（VN10）和SLVYPFPGPIPN（SN12）的分子特性,利用分子对接工具从分子层面研究肽的抑菌活性、研究肽段和不同菌体蛋白（大肠杆菌5BNS、金黄色葡萄球菌4ALM、沙门氏菌6CH3）之间相互作用的分子机制,通过BIOPEP数据库比对表征肽段抑菌活性。研究结果表明：RK7所带净电荷为3.1,疏水性氨基酸比例为42.86%;TL9所带净电荷为0,疏水性氨基酸比例为88.89%;VN10和SN12的疏水力矩分别为0.189和0.372,疏水性氨基酸比例为70.00%和66.67%。RK7和TL9均能和5BNS、4ALM、6CH3形成配体-受体复合物构象,VN10和SN12仅能和4ALM、6CH3形成配体-受体复合物构象;将RK7、TL9、VN10和SN12与抗菌肽数据库比对后发现RK7为抑菌活性已知的肽段,最高相似度为100%,TL9、VN10和SN12为潜在的具有抑菌活性的新型抗菌肽。结合肽段分子特性分析、分子对接和数据库比对预测4种苦味肽的抑菌活性,大肠杆菌抑制活性：RK7 > TL9,金黄色葡萄球菌抑制活性：RK7 > VN10 > TL9 > SN12,沙门氏菌抑制活性：RK7 > TL9 > VN10 > SN12。该研究为分子层面研究牦牛乳硬质干酪苦味肽结构特征及其抑菌活性提供了理论参考。     

绿原酸对α-淀粉酶的抑制作用及其分子对接模拟

作为淀粉消化关键的水解酶之一,α-淀粉酶的水解作用使淀粉快速消化,引发餐后血糖水平迅速升高,持续性的餐后血糖升高与高血糖、高血脂等代谢性疾病发生呈正相关。利用天然化合物抑制α-淀粉酶活性对降低这些代谢性疾病的发生率具有重要意义。以绿原酸和α-淀粉酶为研究对象,通过体外模拟消化实验发现,当底物浓度为10mg/mL时,α-淀粉酶的活力为2U/mL;水解时间为20min时,其抑制率为67.3%,IC₅₀为4.2mg/mL,证实了绿原酸对α-淀粉酶活性的抑制作用。基于酶反应动力学,利用Lineweaver-Burk双倒数绘图法分析发现,酶的抑制类型为混合型抑制。利用分子对接技术揭示了绿原酸与α-淀粉酶的分子间作用,预测绿原酸对α-淀粉酶的抑制机制为混合型抑制,与酶反应动力学结果相符。分子对接模拟结果表明:绿原酸既能够与α-淀粉酶催化活性部位的Glu261、Asp328和Tyr193形成氢键,实现与淀粉的竞争性抑制;同时也能够与α-淀粉酶的His327、Ala232氨基酸残基形成氢键,实现与淀粉酶-底物复合物的非竞争性抑制。基于绿原酸对α-淀粉酶的抑制作用,利用绿原酸抑制淀粉酶活性从而降低淀粉消化率,延缓餐后由碳水化合物引起的血糖快速升高,以期为应用绿原酸开发适合Ⅱ型糖尿病患者的功能食品提供理论依据和有益参考。     

α-乳白蛋白源ACE抑制肽快速筛选及验证

采用生物信息学手段，利用在线工具对α-乳白蛋白进行虚拟酶解，通过对活性肽的活性、毒性及理化性质进行预测，并结合分子对接的方法实现快速精准筛选新的血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽Pro-Glu-Trp（PEW）。通过固相合成法制备出活性肽PEW进行体外活性验证，其半抑制浓度（IC50）为3?130?μmol/L。全柔性分子对接模拟结果表明，PEW与ACE活性口袋S1相互作用可能是其具有ACE抑制活性的主要原因，氢键、疏水作用力、静电力是维持两者结合的主要作用力。与传统方法相比，本研究可以快速高效地筛选出ACE抑制肽，为食源性活性肽的快速筛选提供了新思路。     

豆粕血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定及作用机制解析

以大豆粕为原材料,利用超声辅助酶解技术、超滤-?KTA层析相结合的方法分离纯化获取豆粕酶解产物中血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制肽,对其分子质量分布进行研究,后通过质谱分析与分子对接技术鉴定并筛选出ACE抑制活性肽的氨基酸序列,经固相合成肽序列,检测其ACE抑制肽的活性并基于分子对接技术探索其抑制机制。结果表明：经超声辅助酶解提取获得的豆粕肽分子质量主要分布在6 000 Da以下;根据分子对接的最低预测自由能筛选出的GVRP（－8.44 kcal/mol）和IIVTP（－9.04 kcal/mol）可以抑制ACE活性,半抑制浓度（50% inhibitory concentration,IC50）分别为（84±0.06）、（77±0.08）μmol/L;分子对接结果表明：GVRP、IIVTP能够与ACE的活性口袋S1、S1′、S2形成氢键相互作用,共有的过近接触（3.5 ?范围内）ACE氨基酸残基为His513、Ala354和Glu384。本研究基于串联质谱与分子对接技术,建立从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽的方法,探究活性多肽与ACE稳定结合并体现其ACE活性的抑制机制,为后续的深入研究提供一定参考。     

大河乌猪火腿中新型α-葡萄糖苷酶抑制肽的分离、鉴定及活性研究

大河乌猪火腿在发酵和后熟过程中蛋白质降解可产生丰富的生物活性肽。为探究大河乌猪火腿中是否存在α-葡萄糖苷酶抑制肽及其活性,以大河乌猪火腿为研究对象,通过超滤分离方法制备了不同分子质量的火腿肽;以α-葡萄糖苷酶抑制率为指标,采用肽组学结合生物信息学分析方法对火腿肽进行鉴定、筛选和活性研究。结果表明：分子质量小于3 kDa的大河乌猪火腿肽具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。从大河乌猪火腿中共鉴定出143条主要来源于肌球蛋白、肌钙蛋白和β-烯醇化酶的肽序列,进一步筛选出的肽段IEEALGDK具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC₅₀值为1.42 mg/mL)。BIOPEP-UWM数据库检索结果显示,肽段IEEALGDK为新型的生物活性肽。肽的稳定性研究表明,肽段IEEALGDK具有较好的热稳定性、耐酸碱性和胃肠道消化稳定性。分子对接结果显示,肽段IEEALGDK主要通过氢键和疏水相互作用占据α-葡萄糖苷酶的活性残基位点Arg594、Arg727、Arg799和Arg467发挥活性作用。大河乌猪火腿的肽段IEEALGDK为新型生物活性肽,具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,研...     

促成骨细胞增殖活性骨胶原蛋白肽的靶向筛选及活性分析

酶法制备的骨胶原蛋白肽为混合肽,通常具有多种潜在的生物活性,但目前缺乏基于促成骨细胞增殖活性的靶向性研究。本实验以酶法制备的牦牛骨胶原蛋白肽为原料,采用高效液相色谱法与纳米液相色谱-串联质谱法分别测定混合肽的分子质量与序列构成,基于与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的CDOCKER半柔性对接,靶向筛选具有潜在促成骨细胞增殖活性的骨胶原蛋白肽,并进行体外细胞增殖培养验证。结果表明,共鉴定得到78 条牦牛骨胶原蛋白肽,主要以低分子质量肽段为主（小于3 000 Da的组分占91.8%）,通过与EGFR对接发现,多肽GPAGPQGPRGDKGETGEQ（GP-18,1 736.815 Da）、TPEVDDEALEKFDK（TP-14,1 634.775 Da）、GPAGPQGPRGDKGETGE（GP-17,1 608.757 Da）、GKSGDRGETGPAGPAGPIGPV（GK-21,1 875.951 Da）和GKSGDRGETGPAGPAGPIGPVG（GK-22,1 932.973 Da）具有潜在促成骨细胞增殖活性。小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞培养实验结果表明,3.0 mg/mL GK-22促成骨细胞相对增殖率达106%,显著高于空白组（P＜0.05）。本研究可为促成骨细胞增殖活性肽的靶向筛选和工业化制备提供理论参考。     

鼠尾草酸对α-淀粉酶的抑制作用

抑制α-淀粉酶的活性可以有效降低餐后血糖浓度升高,故本实验从抑制率、抑制类型、荧光猝灭效应及分子模拟几个方面出发研究鼠尾草酸对α-淀粉酶的抑制作用。结果显示,鼠尾草酸对α-淀粉酶有较为显著的抑制作用,半数抑制浓度为1.12 mg/mL,以可逆的竞争性方式抑制α-淀粉酶的活性。荧光猝灭实验结果表明,鼠尾草酸与α-淀粉酶结合后使α-淀粉酶的荧光特性发生静态猝灭。分子对接结果显示鼠尾草酸与α-淀粉酶作用后没有催化底物生成新的产物,而是形成可逆的酶-抑制剂复合物,引起变构调节,从而扰乱了α-淀粉酶的构象动力学,最终导致酶催化活性降低。     

康定灵芝功效成分分析及体外抗氧化、降血糖活性评价

本文采用药典方法和高效液相色谱法分析了康定灵芝多糖、三萜及灵芝酸A、灵芝酸C1、灵芝酸F的含量。通过对DPPH、ABTS+自由基清除能力和总抗氧化能力的考察以及对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果评价了其体外抗氧化和降血糖活性。结果显示,康定灵芝多糖和三萜含量分别为1.15%和1.50%,灵芝酸A、灵芝酸C1和灵芝酸F含量分别为0.052%、0.020%和0.064%。体外抗氧化和降血糖活性评价结果表明康定灵芝多糖提取物对DPPH和ABTS⁺自由基清除的IC₅₀值分别为0.75 mg/mL和1.24 mg/mL,对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制的IC₅₀值分别为1.45 mg/mL和1.97 mg/mL。三萜提取物对DPPH和ABTS⁺自由基清除的IC₅₀值分别为0.65 mg/mL和1.06 mg/mL,对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制的IC₅₀值分别为1.44 mg/mL和1.09 mg/mL。本文研究结果表明康定灵芝功效成分含量高,同时具有良好...     

大蒜油的抗凝血作用

为研究大蒜油的抗凝血作用,本实验从大蒜中分离提取大蒜油,经气相色谱-质谱联用仪鉴定该大蒜油中主要成分为二烯丙基硫醚（allyl sulfide,DAS）、二烯丙基二硫醚（diallyl disulfide,DADS）和二烯丙基三硫醚（diallyl trisulfide,DATS）。体外实验结果表明大蒜油、DAS、DADS、DATS均具有部分抑制凝血酶活性功能,且抑制作用由强到弱依次为DATS＞大蒜油＞DADS＞DAS。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法进行酶动力学分析,结果表明大蒜油、DAS、DADS、DATS对凝血酶的抑制作用属于混合性抑制（竞争性和非竞争性抑制）。分子荧光光谱分析结果表明大蒜油、DAS、DADS、DATS能与凝血酶蛋白中的发色基团相互作用导致荧光猝灭。三维分子对接分析结果显示出DATS与凝血酶结合性能良好;二维分子对接分析结果显示出DATS与凝血酶蛋白活性位点处Asp189、Gly219和Ala190形成氢键,与酶活性位点的Gly216、Ser195、Trp215形成疏水作用力,体现竞争性抑制作用,与非活性位点Gly226、Asp221A、Tyr225、Glu217、Cys191、Val213形成疏水作用,体现非竞争性抑制作用。体内实验结果表明,大蒜油、DAS、DADS、DATS分别通过正向调控大鼠凝血四项指标而直接展现出抗凝血功能,且抗凝血能力依次为DATS＞DADS＞DAS＞大蒜油。大鼠体内抗氧化实验结果表明大蒜油、DAS、DADS、DATS均只有微弱抗氧化能力,大蒜油、DAS、DADS、DATS具有的抗凝血功能应与其抗氧化能力不相关。     

Anti-diabetic activity peptides from albumin against α-glucosidase and α-amylase

The objectives of this study were to identify novel peptides from albumin, and to evaluate and validate the anti-diabetic activity of peptides against α-glucosidase and α-amylase. In the research, albumin hydrolysate was purified and identified, tandem MS was adapted to characterise the amino acid sequences of peptides from the hydrolysate. In addition, anti-diabetic effects of the peptides with α-glucosidase and α-amylase inhibitory activity have been performed. The present work found eight novel peptides from albumin. Results also suggested that peptide KLPGF had α-glucosidase inhibitory activity with an IC(50) of 59.5±5.7μmoll(-1) and α-amylase inhibitory activity with an IC(50) of 120.0±4.0μmoll(-1). In conclusion, the results revealed that the peptide KLPGF was a potential anti-diabetic inhibitor.     

茶多酚对α-淀粉酶的抑制作用及分子机理

探究茶多酚对α-淀粉酶的抑制特性并分析其分子作用机制。采用抑制动力学的方法评价茶多酚对α-淀粉酶的抑制作用;通过荧光色谱法及圆二色谱法观察茶多酚对α-淀粉酶空间结构和稳定性的影响;利用分子对接技术,探究茶多酚与α-淀粉酶之间的分子相互作用。结果表明,茶多酚对于α-淀粉酶的活性具有明显的抑制作用,竞争类型为非竞争性抑制,半抑制浓度为1.35 mg/mL;茶多酚对α-淀粉酶具有荧光猝灭效应,其最大发射波长（λ_max）出现红移,α-淀粉酶的二级结构由层状结构向螺旋结构转变,其稳定性显著降低;茶多酚通过氢键、疏水相互作用等与α-淀粉酶形成稳定复合物,从而降低了酶的催化活性。研究结果表明,茶多酚具有作为α-淀粉酶抑制剂的潜在价值。     

芹菜素-8-C-葡萄糖苷对淀粉消化酶抑制作用机制

采用酶活动力学、荧光光谱、圆二色谱和分子对接等技术系统探究芹菜素-8-C-葡萄糖苷对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性调控效果及机制。结果显示,芹菜素-8-C-葡萄糖苷对α-葡萄糖苷酶有良好的抑制效果,IC50值为293.5 mg/L,抑制类型为非竞争性抑制。但对α-淀粉酶无显著抑制效果。荧光光谱结果表明芹菜素-8-C-葡萄糖苷可作为猝灭剂分子与α-葡萄糖苷酶结合,发生静态猝灭,改变酶蛋白氨基酸疏水环境。圆二色谱则显示芹菜素-8-C-葡萄糖苷和α-葡萄糖苷酶之间的相互作用使酶分子的二级结构变得松散,α-螺旋和β-转角下降。分子对接结果进一步证实芹菜素-8-C-葡萄糖苷和α-葡萄糖苷酶之间作用力主要为氢键,最低结合能为-7.2 kcal/mol。本研究揭示了芹菜素-8-C-葡萄糖苷对淀粉消化酶尤其是α-葡萄糖苷酶的抑制作用机制,为未来将芹菜素-8-C-葡萄糖苷作为健康食品辅料或药物开发提供一定理论基础。     

苦荞中芦丁和槲皮素对淀粉消化酶的抑制能力

采用多种光谱技术手段研究苦荞中芦丁和槲皮素对淀粉消化酶的抑制效果和作用机制,及二者联合使用时的抑制效果。结果表明：芦丁和槲皮素对α-淀粉酶的抑制类型均为疏水相互作用力和以氢键为主要驱动力的竞争性抑制,半抑制浓度分别为0.36 mg/mL和0.22 mg/mL;对α-葡萄糖苷酶均为通过氢键结合的混合型抑制,半抑制浓度分别为1.30 mg/mL和0.362 mg/mL。同时,二者均能与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶结合形成复合物从而抑制酶的活性,且只存在一个（或一类）作用位点;二者按照不同浓度比联合使用均可对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶产生协同抑制的作用,当二者浓度比为7∶1和3.6∶18时,对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的联合指数分别达到0.20和0.22,苦荞中黄酮对两种消化酶达到最佳协同抑制效果。本研究为进一步阐明黄酮与淀粉消化酶相互作用机制提供一定理论基础,对指导富含黄酮食药同源植物的加工利用具有较高的指导价值,有利于促进苦荞产业的良性循环。     

Novel peptides derived from egg white protein inhibiting alpha-glucosidase

The aim of this study was to search and identify potential anti-diabetic peptides with α-glucosidase and α-amylase inhibitory activities. After the Alcalase hydrolysis, egg white protein hydrolysates were purified and identified by LC–MS–MS. Eight identified peptides were further synthesized by the Fmoc solid-phase synthesis. The anti-diabetic activities of these synthetic peptides were assessed using enzymatic inhibitory assays against the α-glucosidase and α-amylase. Among the eight peptides, peptide RVPSLM was discovered as a potential α-glucosidase inhibitor with an IC₅₀ value at 23.07 μmol L⁻¹. However, it did not exhibit a visible or detectable inhibitory efficiency on the α-amylase. These studies indicate the potential of using egg white protein hydrolysates as a functional food product with the anti-diabetic activity.     

SUBUNIT STRUCTURES AND ESSENTIAL AMINO ACID RESIDUES OF WHITE KIDNEY BEAN (PHASEOLUS VULGARIS) α-AMYLASE INHIBITORS

Both white kidney bean α-amylase inhibitors WKB 858A (MW 42,000) and WKB 858B (MW 20,000) were composed of two subunits as determined by N-terminal amino acid analysis by amino acid sequence, by SDS-PAGE and by separation on a chromatofocusing column in 8 M urea. N-Terminal amino acids for Inhibitor WKB 858A were alanine and glycine, with a sequence of H₂N-Ala-Glu-Asn-Ala-Gly-Thr-Tyr–COOH for deglycosylated 9,000 MW peptide and H₂N-Gly-Asn–COOH for deglycosylated 12,000 MW peptide. N-Terminal amino acids for Inhibitor WKB 858B were alanine and serine, with a sequence of H₂N-Ala-Thr-Glu-Thr-Ser–COOH for the deglycosylated 9,000 MW peptide and H₂N-Ser-Ala-Val-Gly-Leu-Asp-Phe-Val-Leu-Val-Pro-Val-Gin-Pro-Glu-Ser-Lys-Gly-Asp-Thr-VaVal-Glu-Phe-Asp–COOH for the deglycosylated 15,000 MW peptide. Chemical modification of 2 of 7 His residues with diethylpyrocarbonate resulted in 26% loss of inhibitory activity. Modification of 1.5 of 7 Trp residues with N-bromosuccinimide gave 60% loss of inhibitory activity. Modification of 2 of 6 Tyr residues with N-acetylimidazole gave 60% loss of inhibitory activity. Modification of 3.6 of 6 Arg residues with p-hydroxyphenylglyoxal gave 64% loss of inhibitor activity. These results indicate the possible importance of one or more His, Trp, Tyr and perhaps Arg residues for inhibitory activity against porcine pancreatic α-amylase.