糙米中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及其毒力基因与药敏性检测

本文从一份糙米样品中分离纯化出5株细菌,分别命名为BR1、BR2、BR3、BR4和BR5,对其进行形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA及gyrB基因测序鉴定,并对其毒力基因及药物敏感性等生物学特征进行研究。结果表明,5株分离菌株生化特性符合蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的特性,结合16S rRNA及gyrB基因测序结果,菌株BR1和BR4鉴定为蜡样芽孢杆菌。毒力基因的PCR检测结果表明,菌株BR1和BR4携带肠毒素基因（hbl、nhe、entFM和bceT）和细胞毒素K基因（cytK）,未检测到呕吐型毒力基因（cer和ces）。菌株BR1和BR4对青霉素、氨苄西林和头孢噻肟等药物耐药,对阿莫西林中度敏感,对诺氟沙星、环丙沙星和庆大霉素等药物敏感。本研究通过分离鉴定糙米源蜡样芽孢杆菌,发现分离菌株携带多种毒力基因,并且对青霉素类、头孢菌素类及磺胺类等药物耐药,表明糙米中的蜡样芽孢杆菌有引起食源性疾病的风险。     

食品中克罗诺杆菌分离菌株生物被膜形成、耐药性及毒力基因检测

研究食品中克罗诺杆菌分离菌株的生物被膜形成、耐药性以及携带毒力基因情况。在成都市周边农贸市场和路边小摊采集食品样品129份,采用DFI 阪崎肠杆菌显色培养基分离克罗诺杆菌;通过16S rRNA序列比对分析鉴定分离菌株;采用试管法和微孔板法分析菌株生物被膜形成能力,同时研究温度对细菌成膜能力影响;采用纸片法检测分离菌株对18种抗生素的耐药性;采用PCR方法检测分离菌株携带cpa、hly、sip 和ompX毒力基因情况。结果发现从129份食品样本中共检出克罗诺杆菌43株,检出率为33.3%。43株克罗诺杆菌食品分离菌株的成膜率为90.7%,并且温度对细菌成膜影响明显。四种毒力基因中,ompX检出率为100%;cpa检出率为13.9%;hly检出率为11.6%;sip基因未检出。耐药表型检测发现43株克罗诺杆菌食品分离菌株对青霉素、克林霉素、万古霉素、苯唑西林和杆菌肽B的耐药率为100%,对利福平的耐药率达97.7%;对红霉素的耐药率为7%;对环丙沙星、庆大霉素、四环素、氯霉素、亚胺培南、磺胺甲恶挫、呋喃妥因、头孢西丁、链霉素、阿米卡星、氧氟沙星等100%敏感。本研究表明克罗诺杆菌食品分离菌株具有较好的形成生物被膜能力,对常见的抗生素耐药率较高,并且分离菌株携带一定的毒力基因,对食品安全造成潜在威胁。     

辽宁省婴幼儿食品中肠集聚性大肠埃希菌的病原学特征及耐药谱研究

目的 对2018—2020年辽宁省婴幼儿食品中致泻大肠埃希菌开展持续监测,了解和掌握本省内致泻大肠埃希菌的病原学特征、药物敏感性特征,为本省致泻大肠埃希菌流行病学研究奠定坚实基础,为可能导致的食源性疾病合理用药提供依据。方法 采集辽宁省共208份婴幼儿食品,分离肠杆菌科细菌,并进行16S rRNA基因测序分析与生化鉴定。对鉴定得到的大肠埃希菌进行毒力基因检测,收集分离的肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）进一步进行血清学分型和耐药谱研究。结果 16S rRNA基因测序通过对肠杆菌科进行种鉴定,发现与生化结果一致。其中EAEC的检出率较高,且EAEC的毒力基因pic携带率高。毒力基因分型和血清分型具有一致性。共检测出25株EAEC,其中40%菌株（血清型O134:H9）携带毒力基因pic,28%菌株（血清型O3:H2）同时携带毒力基因aggR和astA,16%菌株（血清型O9:H6）携带毒力基因aggR,16%菌株（血清型O62:H7）携带毒力基因astA。78株大肠埃希菌中EAEC毒力基因的携带率为32.1%。25株EAEC为多重耐药株,主要对β内酰胺类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类抗菌药...     

冷冻整鸡样本中单株猪红斑丹毒丝菌的鉴定及生物学特性

目的 探讨冷冻整鸡样本来源的单株猪红斑丹毒丝菌致病性、耐药性及生物学特征,为该菌防治供科学依据。方法 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）和全基因组测序技术进行菌株鉴定和分子生物学研究,采用纸片扩散法（K-B法）检测其耐药表型,通过体外生物被膜形成实验检测其生物被膜形成能力,通过ParSNP构建亲缘关系图。结果 MALDI-TOF MS可以准确地鉴定猪红斑丹毒丝菌,该菌染色体大小为1,791,362 bp,G+C含量36.5%,含有1730个蛋白质编码序列,53个tRNA和2个rRNA,基因组分析暂未发现质粒;携带四环素类耐药基因tet(M),抗菌药物敏感性实验结果显示仅对四环素耐药,耐药基因和耐药表型一致;携带7个与黏附和荚膜形成相关的毒力基因;体外生物被膜形成能力适中（2+）;与韩国分离株KCSbR1亲缘关系较相近。结论 本研究阐明了冷冻整鸡样本中猪红斑丹毒丝菌分离株的生物学特性,为该菌科学有效防控提供理论依据。     

食品中蜡样芽孢杆菌的分离及携带毒力基因的检测

为了确定成都市食品中蜡样芽孢杆菌所携带的毒力基因情况,本实验对市售食品共采样130份,通过菌落在MYP培养基上形态特征对蜡样芽孢杆菌进行初步分离,再利用16Sr RNA测序结果进行比对分析,并检测分离菌株携带的管家基因gyr B、rpo B、Vrr A、gro EL进一步确认,最后检测分离菌株携带毒力基因情况。结果表明130份样品中共检出23株蜡样芽孢杆菌,检出率为17.7%;23株分离菌株中,蜡样芽孢杆菌的4个管家基因gyr B、rpo B、Vrr A、gro EL检出率为100%,毒力基因的检测结果表明,nhe B和ent FM在16株分离菌株中检出,检出率为69.6%;nhe A和nhe C在14株分离菌株中检出,检出率为60.9%;hbl D在11株分离菌株中检出,检出率为47.8%;cyt K在10株分离菌株中检出,检出率为43.5%;bce T在9株分离菌株中检出,检出率为39.1%;hbl A和hbl C在8株分离菌株中检出,检出率为34.8%;cer和ces在2株分离菌株中检出,检出率为8.7%;未发现分离菌株携带hbl B和Hly基因。研究结果表明市售食品中分离的蜡样芽孢杆菌毒力基因携带率较高,对食品安全具有潜在威胁,应当引起有关部门注意。     

金黄色葡萄球菌耐药性与生物被膜能力的鉴定

本文选择常见的典型食源性微生物金黄色葡萄球菌,从食品微生物安全角度出发,对127株葡萄球菌的菌株特性、耐药性与生物被膜生长能力进行研究,包括菌株生化鉴定;PCR扩增葡萄球菌特异16S rRNA与金葡菌特异femA基因,通过对耐药基因mecA和orfX检测确定菌株的耐药特性;最后,运用结晶紫染色法进行生物被膜能力检测。127株菌株包括119株金葡菌(均携带16S rRNA与femA)与8株凝固酶阴性葡萄球菌8株(仅携带16S rRNA)。119株金葡菌中,107株携带mecA基因与orfX基因,为耐甲氧西林金葡球菌(MRSA);8株凝固酶阴性葡萄球菌中,均携带mecA基因。所有菌株均能生成生物被膜,其中能形成强、中等与弱粘附生物被膜能力菌株分别有5(3.9%)、47(37.0%)和75(59.1%)株。金葡菌中耐药性与生物被膜较为普遍,由于食源性微生物形成生物被膜后,具有逃逸常规消毒和杀菌手段的能力,成为食品安全中的潜在隐患。     

成都市市售食品中蜡样芽胞杆菌污染状况与毒力基因分析

目的研究成都市市售食品中蜡样芽胞杆菌毒力基因携带及对抗生素的耐药情况。方法 2014—2016年,在成都市农贸市场和路边摊点共采集食品样品330份,按照GB 4789.14—2014《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》分离疑似菌株,应用管家基因和16S rDNA测序鉴定蜡样芽胞杆菌,并针对分离菌株携带的毒力基因及对抗生素的耐药性进行检测。结果 2014—2016年,蜡样芽胞杆菌总检出率为17.6%(58/330),不同类型食品蜡样芽胞杆菌检出率差异有统计学意义(χ~2=29.683,P0.01),不同年份的食品样品蜡样芽胞杆菌的分离率差异无统计学意义(χ~2=5.835,P0.05)。米面制品、即食凉拌类和腌卤制品是蜡样芽胞杆菌的主要污染食品。腹泻型毒素基因(hbl,nhe,bceT,cytK,entFM)的检出率远高于呕吐型毒素基因(ces和cer)。分离菌株对四环素、红霉素、克林霉素的耐药率分别为29.3%(17/58)、24.1%(14/58)和22.4%(13/58)。结论成都市市售食品中蜡样芽胞杆菌分离菌株携带毒力基因类型多样,对四环素、红霉素、克林霉素的耐药率较高,对食品安全具有潜在威胁。     

生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究

目的:研究生鲜食品中蜡样芽孢杆菌的毒力基因及耐药性。方法:在成都市周边农贸市场和路边小摊采集各种生鲜食品共100份,采用MYP选择性培养基初步分离蜡样芽孢杆菌菌株,采用16S rRNA序列比对分析鉴定得到蜡样芽孢杆菌分离菌株,采用PCR检测分离鉴定菌株中蜡样芽孢杆菌13个毒力基因的携带情况,进一步采用纸片扩散法检测菌株对18种抗生素的耐药性。结果:从100份生鲜食品样本中,检出蜡样芽孢杆菌24株,检出率为24%,其中,路边小摊的检出率(70%)高于农贸市场(18.9%)。呕吐型基因ces和cer的检出率较低,仅在1株中发现;腹泻型基因nheC有24株检出;cytK有13株检出;bceT有12株检出;hblA有11株检出;nheB有10株检出;hblC、hblD、nheA各有9株检出;hly-Ⅱ有7株检出;hblB、entFM检出率为0;蜡样芽孢杆菌的4个看家基因rpoB、gyrB、groEL、vrrA在24株分离菌株中检出率为100%。同时发现,生鲜食品来源的蜡样芽孢杆菌分离菌株对杆菌肽B、磺胺甲亚唑、苯唑西林、青霉素表现出较高耐药性,耐药率大于96%;而对阿米卡星、氯霉素、庆大霉素、亚胺培南耐药率小于7%。结论:本研究通过分离鉴定生鲜食品源蜡样芽孢杆菌,研究其毒力基因携带及耐药性,为进一步评价生鲜食品中蜡样芽孢杆菌的安全风险提供参考数据。     

猪源金黄色葡萄球菌lsa(E)基因的流行性研究

多重耐药菌的传播对食品安全和人们健康造成严重威胁。为研究介导细菌对林可胺类、截短侧耳素类及链阳菌素A类耐药的lsa(E)基因及其基因簇在猪源金黄色葡萄球菌中的流行情况,对厦门三个猪场分离得到的29株金黄色葡萄球菌进行lsa(E)基因检测,用overlapping PCR对lsa(E)基因阳性菌株进行耐药基因簇的扩增,并用药敏纸片法检测菌株对抗菌药物的敏感性。结果表明,29株金葡菌全部携带lsa(E)基因,且aad E-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp基因簇检出率为96.6%(28/29)。药物敏感实验结果显示,29株lsa(E)基因阳性的金葡菌对克林霉素、克拉霉素、庆大霉素的耐药率分别为100.0%、100.0%、72.4%,对复方新诺明、四环素、环丙沙星的耐药率均为96.6%。未发现有对苯唑西林、喹奴普汀/达福普汀和利奈唑胺耐药的菌株。细菌多重耐药率为100.0%,且耐药谱主要为PEN-GEN-TET-CLA-SXT-CLI-CIP-MXF。研究旨在为临床治疗食源性致病菌引起的食品安全问题和控制多重耐药菌随食品链的传播提供一定的科学依据。     

明永冰川低温细菌分离鉴定及生物学特性

对明永冰川冰舌地区的细菌进行分离培养和鉴定。通过土壤悬浮涂布法和平板划线法分离纯化细菌,并做生理生化特性、16S rRNA基因序列测定及系统发育分析。从明永冰川地区分离纯化出22株可培细菌,16S rRNA基因序列分析结果表明:菌株MY0504与黄杆菌属梭菌(Flavobacterium pectinovorum)亲缘关系最近(97.6%);菌株MY1413和MY14015分别与Arthrobacter psychrophenolicus和Arthrobacter parietes有很近的亲缘关系(98%);MY14011与河流色杆菌(Chromobacterium fluviatile)进化关系最近(97%),其余18株菌均鉴定为假单胞菌属的菌株(Pseudomonas spp.)。作者对该地区微生物资源进行初步探究,为了解冰川低温微生物多样性提供参考。     

61株水源性铜绿假单胞菌耐药分析及其16S rRNA系统发育学研究

目的 采用16S rRNA基因序列分析法对2018~2020年间分离自广东地区桶装水中的61株铜绿假单胞菌进行同源性分析,并探讨其对11种不同抗生素的耐药性。方法 采用27F/1492R通用引物对目标菌的16S rRNA基因序列扩增,测序后,采用Clustal X软件进行序列比对,利用MEGA 7.0软件构建系统发生树;药敏实验应用微生物全自动鉴定及药敏系统检测。结果 系统发育分析结果表明：61株共可分为3个分支,分别包含15株一支、1株一支、45株和铜绿假单胞菌标准菌株ATCC 27853一支;药敏结果显示61株铜绿假单胞菌处于较低耐药水平,对所有测试抗生素的耐药率均低于2%,但仍发现一株6重耐药菌株。结论 本研究初步建立了广东地区水源性铜绿假单胞菌的菌株资源库及药敏数据库,为之后的污染溯源工作提供了数据支持,从而保障广大消费群众的饮水安全。     

家禽屠宰场微生物菌群结构及大肠杆菌耐药性评估

家禽屠宰场的水体、地面和屠宰器械表面微生物对鸡肉微生物交叉污染有重要的影响。本研究的主要目的是分析家禽屠宰场水体、地面和与鸡肉接触的屠宰器械表面的细菌结构及其耐药基因携带状况,并从中分离大肠杆菌进行耐药性评估和肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction,ERIC-PCR）分型分析。在浙江省某大型屠宰场的挂禽间、宰杀沥血间、浸烫脱羽间、净膛间、预冷间、包装间、冷藏间、内脏间区域采集水体,并用无菌纱布擦拭各区域的地面和器械表面采集微生物,基于16S rRNA V3～V4的Illumina高通量测序方法分析其菌群结构多样性,并从中分离大肠杆菌,分别用PCR对总细菌和大肠杆菌进行9大类耐药基因的检测分析和大肠杆菌的ERIC-PCR分型研究。结果表明：屠宰场不同区域水体、地面和屠宰器械表面微生物均以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）为主;优势菌属为不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属（Streptococcus）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）等一些腐败菌属与致病菌属。屠宰场不同区域的水体、地面和屠宰器械表面存在的耐药基因种类较多,共检测到21 种耐药基因分布在这些样品中,其中sulI、sulII、blaTEM、aadA1、floR、tetA、ereA和qnrS等8 种耐药基因检出率达88.9%以上,与从中分离的大肠杆菌耐药基因检出情况吻合度较低,这表明还存在其他携带耐药基因的菌株,此外分离的大肠杆菌菌株多重耐药现象严重。ERIC-PCR分型结果表明,大肠杆菌可以沿屠宰生产链进行克隆传播。本实验将为探究屠宰环境微生物与鸡肉污染微生物之间的关系提供理论参考。     

食源性变形杆菌氨基糖苷类修饰酶基因及16S rRNA甲基化酶基因研究

目的了解食源性变形杆菌的氨基糖苷类耐药基因情况。方法收集2011—2014年石家庄市售各类食品中分离到的对阿米卡星和庆大霉素至少有一种耐药的变形杆菌124株,用PCR、测序和基因库在线比对方法分析6种氨基糖苷类修饰酶基因与3种16S r RNA甲基化酶基因。结果 124株变形杆菌中氨基糖苷类修饰酶耐药基因aac C2、aac A4、aad A1和aph A6的检出率分别为95.2%(118/124)、80.6%(100/124)、73.4%(91/124)和5.6%(7/124);16S r RNA甲基化酶耐药基因rmt B检出率为87.1%(108/124)。aac C1、aad B、arm A和rmt C基因均未检出。结论 aac C2型氨基糖苷类修饰酶基因与rmt B型16S r RNA甲基化酶基因流行是食源性变形杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药的重要原因。     

Virulence factors and genetic variability of Staphylococcus aureus strains isolated from raw sheep's milk cheese

Contamination of dairy products with Staphylococcus aureus can be of animal or human origin. The host pathogen relationship is an important factor determining genetic polymorphism of the strains and their potential virulence. The aim of the present study was to carry out an extensive characterization of virulence factors and to study the genetic variability of S. aureus strains isolated from raw ewe's milk cheese. A total of 100 S. aureus strains isolated from cheese samples produced in 10 artisan cheese factories were analyzed for the presence of enterotoxins (sea-see) and enterotoxins-like genes (seh, sek, sel, sem, seo, sep), leukocidins, exfoliatins, haemolysins, toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1) and the accessory gene regulator alleles (agr). Strains were also typed using pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). AMOVA analysis carried out on PFGE and PCR data showed that the major component explaining genetic distance between strains was the dairy of origin. Of the total isolates 81% had a pathogenicity profile ascribable to "animal" biovar while 16% could be related to "human" biovar. The biovar allowed to estimate the most likely origin of the contamination. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of nine antimicrobial agents and the presence of the corresponding genes coding for antibiotic resistance was also investigated. 18 strains carrying blaZ gene showed resistance to ampicillin and penicillin and 6 strains carrying tetM gene were resistant to tetracycline. The presence of mecA gene and methicillin resistance, typical of strains of human origin, was never detected. The results obtained in the present study confirm that S. aureus contamination in artisan cheese production is mainly of animal origin.     

云南淡水鱼中单增李斯特氏菌污染状况及耐药性分析

目的了解云南淡水鱼中单增李斯特氏菌污染状况及耐药情况。方法从云南省昆明市、曲靖市、大理州、红河州4个淡水鱼主产区采集淡水鱼样品110件,参照GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》分离鉴定单增李斯特氏菌,并进一步开展16S rRNA序列鉴定和同源性分析,对鉴定菌株采用微量肉汤稀释法分析抗生素敏感性。结果110件样品检出2株单增李斯特氏菌(DZ-054、DZ-101),检出率为1.82%。2株单增李斯特氏菌之间相似度达到99.64%。DZ-101菌株对氨苄西林、青霉素敏感(S),DZ-054菌株对抗生素不敏感。结论云南省淡水鱼中单增李斯特菌的污染率较低,但仍有一定的安全隐患,相关部门应加强监管。     

武汉地区食源性沙门氏菌耐药特征分析

目的分析武汉市售肉类中分离的82株沙门氏菌的药物敏感性及耐药基因。方法根据美国临床和实验室标准协会(Clinical&Laboratory Standards Institute,CLSI)相应标准获得沙门氏菌耐药实验种类和浓度,定制药敏板,采用最低抑菌浓度法(minimum inhibitory concentration,MIC)进行药敏实验,并通过PCR方法检测耐药基因的携带情况。结果药物敏感性试验结果显示,82株沙门氏菌对四环素耐药率最高,有66株菌株对四环素耐药,耐药率高达79.52%,对复方磺胺和氨苄西林的耐药率较高,耐药率分别为49.40%和48.19%;对头孢类药物的耐药率较低,对亚胺培南未表现出耐药性。耐药基因检测结果显示,82株沙门氏菌中四环素耐药基因tetA的检出率最高,且有54株沙门氏菌携带多重耐药基因,头孢类药物耐药基因blaCTX检出率较低,仅为3.66%。结论武汉市食源性沙门氏菌耐药情况较为严重,部分常见抗生素耐药性较高,对临床用药治疗和食源性病菌预防造成巨大的影响。     

Molecular typing of Lactobacillus delbrueckii of dairy origin by PCR-RFLP of protein-coding genes

Thirty-five strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis and subsp. bulgaricus isolated from dairy products were typed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) of protein-coding genes. The strains were analysed by RFLP of PCR amplified, infragenic fragments of the following housekeeping genes: beta-galactosidase, lactose permease, and proline dipeptidase. Sequencing of the variable regions of the 16S rDNA was then performed on a reduced number of strains. PCR-RFLP analysis evidenced wide strain heterogeneity. Strains were grouped into genotypes according to both subspecies assignment and infra-species genetic polymorphism. This polymorphism was related to the presence of microbial groups within subspecies populations. The low infra-species sequence polymorphism detected in the variable region of the 16S rRNA gene did not enable to group the strains with the same sensitivity reached by PCR-RFLP of protein-coding genes. PCR-RFLP of protein-coding genes applied to L. delbrueckii seems a promising tool to evaluate microbial diversity within bacterial subpopulations. Differences among bacterial subpopulations based upon molecular heterogeneity in protein-coding genes would enable to better understand the role of strains from different ecological niches.     

北京地区肉类中沙门氏菌全基因组分型及耐药分析

目的对我国北京地区肉类产品中沙门氏菌进行分离鉴定,基于全基因组测序结果,分析其耐药基因分布情况及亲缘关系。方法以38株沙门氏菌为研究对象,对不同来源的沙门氏菌进行全基因组分析,然后通过测定菌株对15种抗生素的最小抑菌浓度,结合全基因组测序结果分析不同来源的沙门氏菌的耐药特性及多重耐药状况。结果对38株沙门氏菌进行15种抗生素耐药性检测,其中34.2%为多重耐药株,68.4%的沙门氏菌对喹诺酮萘啶酸耐药,42.1%分离株对氨苄西林耐药。基于全基因组测序结果,对38株沙门氏菌进行分型为12种型别,其中88.2%的肠炎沙门氏菌与标准菌株ATCC9184亲缘关系较近。结论全基因组耐药基因和毒力基因与耐药表型有一定的关联,为监控北京地区的沙门氏菌耐药基因和毒力基因的传播方式提供理论基础。