鲢鱼卵高分子质量CPI-I 的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的粗提浓缩液,进而经Q Sepharose Fast Flow阴离子层析和Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化了的CPI-I。以偶氮酪蛋白(azocasein)法监测粗提液及层析纯化中CPIs的抑制活性。层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测洗脱物的CPIs抑制活性的热稳定性。最终鲢鱼卵CPI-I被纯化了72倍,酶回收率为10.25%。利用Sephacryl S-200分子筛层析Marker标准曲线以及反相酶谱法,初步判断CPI-I的分子质量为89kD。高碘酸-Schiff试剂(PAS)染色法证明该蛋白为糖蛋白。CPI-I能够抑制鲢鱼组织蛋白酶L,且具有显著的热稳定性。     

鲢鱼肝脏中高分子CPIs提取方法的建立及其鉴定

研究了不同浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)、热处理条件及pH值对鲢鱼肝脏中高分子半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)提取过程中的作用,根据其对CPIs在TSK液相上高分子质量部分的蛋白峰值和比活力(荧光合成肽底物法)的影响,确定了最佳粗提条件为:以含5 mmol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),100mmol/L的Tris,3 mmol/L的EDTA(pH 7.5)作为提取缓冲液,而后在pH 8.7碱处理条件下经90℃加热5 min后,再回调到pH 7.0。用该法制备的鲢鱼肝脏CPIs粗提物经制备型Sephacryl S-200分子筛层析,分离得到的高分子活性部分,进一步经过反相酶谱法鉴定得到一种高相对分子质量的活性CPI,推测其可能是与某些蛋白结合形成了复合物,或是高分子CPIs的二聚体形式。     

鲢鱼卵中两种高分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料,通过匀浆、酸处理和超滤制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cystine proteinase inhibitors,CPIs）粗提液,进而经Sephacryl S-100分子筛层析、Blue Sepharose 6 Fast Flow染料亲和层析、SP-SepharoseFast Flow阳离子交换层析、ConA Sepharose 4B亲和层析,获得两种纯化的高分子CPIs,即ConA不吸附部分a-1和吸附部分的糖蛋白a-2。二者分别被纯化了102.62 倍和274.28 倍,酶活回收率分别为2.02%和1.42%。通过TSK G2000 SWXL凝胶过滤高效液相色谱结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及其反相酶谱法分析,表明a-2及再次经高效液相色谱法回收的a-1在电泳图上均呈单一带,a-2为单一峰,且a-1的分子质量为139 ku,a-2的分子质量为92 ku。二者均能抑制半胱氨酸蛋白酶（木瓜蛋白酶和鲢鱼组织蛋白酶L）但不抑制丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）。根据a-1和a-2的分子质量及抑制活性特征和糖蛋白特性,推测二者可能为鲢鱼卵Kininogens的不同形式。     

大豆过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

新鲜大豆芽经匀浆、磷酸缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的过氧化氢酶。该酶酶活回收率为30.92%,纯化倍数为293.09,酶比活力达到26 322.43 U/mg。该酶全分子质量为234.9 kD,亚基分子质量为57.42 kD;最适pH值为7.2,最适温度为30 ℃,在pH 4.0～10.6及25～35 ℃范围内有较好的稳定性;在30 ℃、pH 7.2条件下测得该酶对过氧化氢的Km值为31.82 mmol/L;十二烷基硫酸钠、草酸、Ag+、Cu2+对该酶有强烈的抑制作用,Pb2+对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用而高浓度时抑制酶活性。     

鲢鱼背肌组织蛋白酶L的初步分离及蛋白层析纯化方法

研究鲢鱼背肌中组织蛋白酶L的初步分离和纯化方法,重点研究初步分离过程中酸化处理条件、硫酸铵饱和度和透析袋分子质量对粗酶液中组织蛋白酶L活性的影响,以及纯化过程中不同类型离子交换层析柱和离子交换平衡缓冲液pH值对蛋白层析纯化的影响。结果表明:盐析最佳硫酸铵饱和度范围55%~90%,酸处理最优条件pH 3.0,40 ℃热处理10 min后pH值回调至6.0,透析袋最佳分子质量7 000 u。采用弱阴离子交换和分子筛两步层析法,选取20 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液作为弱阴离子柱的平衡缓冲液,可得到45 ku电泳纯组织蛋白酶L,其纯化倍数为487,回收率为22 mg/1 000 g。本法可最大限度地去除杂蛋白且操作简便、回收率高,为探究鱼糜凝胶劣化现象的有效抑制方法奠定了良好的基础。     

牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化及部分酶学性质

取新鲜牛肝,经匀浆、缓冲液抽提、正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等方法纯化,获得了电泳纯的牛肝谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）。经过纯化后的结果：GDH的酶比活力为306.06 U/mg,纯化倍数为93.60 倍,酶活回收率为23.12%。GDH的分子质量为380.2 kD,亚基分子质量约为61.7 kD。酶学性质研究结果表明：GDH的最适反应温度为50 ℃,在温度为30 ℃以下时较稳定;最适反应pH值为8.2,该酶对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的Km值为0.696 mmol/L。甲醇、乙醇、异丙醇、Cd2+、Co2+、Ca2+、Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+对该酶具有抑制作用,低浓度Ba2+、Mg2+、K+、Li+与乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）对其具有一定的激活作用。     

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADH）。纯化结果显示：该酶比活力为1 622.33 U/mg,回收率为29.05%,纯化倍数为34.58;该酶分子质量约为171.79 kD,亚基分子质量约为43.68 kD。ADH酶学性质研究显示：最适反应温度和pH值分别为45 ℃和10.0;在25～45 ℃及pH 7.5～9.0范围内稳定性较好;最适条件下测得该酶对乙醇的Km值为19 mmol/L;正丁醇、氯仿、异丙醇、十二烷基硫酸钠、草酸、Zn2＋、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Mg2＋对该酶有激活作用,EDTA对该酶有双重作用。     

藏灵菇源克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶的分离纯化研究

为获得藏灵菇马克斯克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶(BSH)的纯品,探讨了BSH粗品的分离纯化方法.粗酶液采用硫酸铵分级沉淀,再以DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换介质,分别考察缓冲液pH值、流速和洗脱方式等对BSH分离纯化的影响.结果表明,在40%～70%饱和度的硫酸铵条件下BSH提取效率最高.最佳层析条件为采用pH值为6.5、50mmol/L磷酸钠缓冲体系、1.5mL/min的流速,进行分步洗脱(100mmol/L、350mmol/L、500mmol/L～600mmol/L NaCl及50mmol/L磷酸盐缓冲液3步洗脱).在优化纯化条件下BSH的比活力可达479.55AU/mg,是原粗酶液的23.66倍.     

甘薯叶酸性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究

以新鲜甘薯老叶为材料,经过匀浆、硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Superdex-200凝胶层析等步骤后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得了电泳纯的酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）,纯化后ACP比活力为251.49 U/mg,纯化了169.07 倍,回收率为3.50%。酶学性质研究结果表明：ACP为单亚基酶,全酶分子质量为42.3 kD,单亚基分子质量为41.2 kD;最适反应温度65 ℃,最适pH 5.2;在40 ℃以下和pH 4.0～6.0范围内酶活性较稳定;以对硝基苯磷酸二钠为底物时,测得其米氏常数Km值为0.258 mmol/L;Ca2+和Mg2+对ACP酶活性有明显激活作用,K+和Li+对ACP酶活性无影响,甲醇、乙二胺四乙酸和草酸对ACP酶活性的抑制作用较大;Hg2+和Ag+对ACP酶活性的抑制作用非常明显。     

牛肾溶菌酶的分离纯化及部分酶学性质

将新鲜牛肾匀浆后,经由缓冲液提取,正丁醇除脂,硫酸铵分级沉淀,CM-Sepharose阳离子交换层析,Superdex-200凝胶过滤层析后得到电泳纯的牛肾溶菌酶。结果表明：该酶比活力为15 145.63 U/mg,回收率为29.13%,纯化倍数为231.05;分子质量约12.66 kD,为单亚基酶。最适反应温度为65 ℃,在65 ℃以下较稳定;最适pH 9.0,pH值在3.0～9.0范围内稳定性较好;测得最适条件下牛肾溶菌酶对溶壁微球菌的Km值为0.399 μg/mL;甲醇、乙醇、异丙醇和硫氰化钾（KSCN）对该酶有激活作用;十二烷基硫酸钠、Pb2＋、Ag＋对该酶有明显抑制作用。     

蕹菜过氧化物酶的分离纯化及理化性质

新鲜蕹菜经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶（peroxidase,POD）,该酶的比活力、回收率、纯化倍数和产率分别为35 972.96 U/mg、12.21%、168.48和211.07 U/g。该酶的亚基分子质量为42.7 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为6,并且在20～50 ℃及pH 5～8的范围内具有良好的稳定性。以不同浓度的H2O2为底物,测得该酶的Km值为18.32 mmol/L。NaCl、尿素（Urea）、Zn2+、Mg2+对该酶都具有较强的激活作用,十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、硫氰化钾（potassium thiocyanate,KSCN）、抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）、Ba2+、Mn2+ 、Fe2+、甲醇、乙醇、正丁醇和异丙醇对蕹菜POD活力均有抑制作用,其中抗坏血酸对POD有极强的抑制作用,当浓度为0.01 mol/L时,酶活力接近于0。     

白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶的纯化及酶学特性

通过粗分离、50%～80%饱和度硫酸铵分级沉降、DE-52阴离子交换柱层析等步骤,从白鲢鱼背侧肌中分离纯化出焦磷酸酶。通过变性凝胶电泳分析,该酶在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中仅有一个分子质量为40 kD的条带。酶学特性研究表明,白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶可专一性地水解焦磷酸盐,反应初速率时间范围为0～15 min,最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为7.5。Mg2＋对该酶有明显的激活作用,在Mg2＋浓度为5 mmol/L时酶活力最高。5 mmol/L的Ca2＋、Zn2＋、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均对该酶有强烈的抑制作用。该酶水解焦磷酸四钠的最大反应速率为0.051 U/mg,米氏常数为0.54 mmol/L。     

不同宰杀方式对草鱼肉呈味水溶性成分的影响

以不同宰杀方式草鱼的背部肉为对象,采用高效液相色谱法和氨基酸自动分析法研究不同宰杀方式（自然、急杀、去鳃）对草鱼背部肉核苷酸类化合物和游离氨基酸含量的变化,并测定背部肉pH值、糖原和乳酸的含量。结果表明：自然、急杀、去鳃3 种宰杀方式的草鱼背肉苦味氨基酸含量占总游离氨基酸含量分别为78.95%、68.60%、69.44%,部肉的鲜度K值分别为20.28%、15.49%、12.13%,自然死亡组腺嘌呤核苷三磷酸含量最低,肌苷酸含量最低,鲜度最差。草鱼背肉中pH值的变化与乳酸含量的变化呈负相关,乳酸含量的变化与糖原含量的变化呈负相关,自然死亡的草鱼肉乳酸含量最高,pH值最低。不同宰杀方式对草鱼背肉呈味水溶性成分影响较大,自然死亡的草鱼肉滋味最差,急杀致死和去鳃致死组滋味差别不明显。因此,在加工过程中,要避免鱼血渗入肌肉,造成鱼肉土腥味产生。     

韭菜β-木糖苷酶的分离纯化与部分性质研究

新鲜韭菜经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、羧甲基离子交换层析(carboxymethyl-sephar ose,CMSepharose)再通过Su perdex-200凝胶过滤层析,从而获得电泳纯的β-木糖苷酶。该酶的比活力达到18.25 U/mg,纯化倍数为12.59,回收率为1.83%,分子质量为123.02 k D,亚基分子质量为61.51 k D。通过对β-木糖苷酶的酶学性质研究得到最适温度为65℃,最适p H值为4。该酶在25~55℃及p H 3.0~5.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其米氏常数(K_m)值为0.28 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和Ag+对该酶具有抑制作用,Mn~(2+)和Co~(2+)对该酶具有一定的激活作用。     

草鱼皮胶原的体外自组装动力学研究

体外自组装是天然胶原的重要分子行为特征之一,并对胶原基产品性能产生显著影响。以草鱼皮酶溶性胶原蛋白为研究对象,重点开展胶原体外自组装动力学行为、影响因素、组装纤维的微观结构及其热稳定性能研究。浊度实验和自组装程度分析的结果表明,草鱼皮胶原蛋白具备体外自组装能力,其自组装进程受胶原质量浓度、pH值、离子强度、温度等因素的影响。在pH 7～8、胶原质量浓度3～5 mg/mL、体系温度25～30 ℃以及NaCl浓度0～200 mmol/L条件下胶原自组装进程较快、自组装程度较高;组装动力学分析的结果表明,在较高的离子强度（NaCl浓度300 mmol/L）和较低的组装温度（20 ℃）时,胶原组装进程表现为：成核、组装和平衡3 个阶段,而在较高组装温度（25～30 ℃）和较低离子强度时（NaCl浓度0～200 mmol/L）,胶原组装进程表现为：快速组装段、低速组装段和平衡段;胶原纤维形态学观察结果表明,草鱼皮胶原组装纤维具有典型的D周期特征但D周期长度值（64.6 nm）小于哺乳动物胶原纤维（约67 nm）;示差扫描量热法（differential scanning calorimetry,DSC）分析结果表明,经纤维重组后,草鱼皮胶原蛋白的热稳定性得到明显提升。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化产物的培养提取及制备

以禾谷镰刀菌Fusarium graminearum大型分生孢子定量接种大米培养物,制备毒素粗提液,采用硅胶柱一步洗脱分离、分段收集可同时获得脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）和乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇（acetyldeoxynivalenol,AcDON）,采用一步结晶法即可分别制备获得毒素纯品,并经红外光谱法、液相色谱-质谱联用技术及核磁共振氢谱等分析确证,液相色谱分析表明两种毒素纯度均大于98%。该培养提取及分离制备方法改变了常规多步骤繁琐过程,提供了一种切实有效的、大量制备纯化DON及乙酰化DON毒素的简便方法。     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。