鲢鱼卵高分子质量CPI-I 的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的粗提浓缩液,进而经Q Sepharose Fast Flow阴离子层析和Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化了的CPI-I。以偶氮酪蛋白(azocasein)法监测粗提液及层析纯化中CPIs的抑制活性。层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测洗脱物的CPIs抑制活性的热稳定性。最终鲢鱼卵CPI-I被纯化了72倍,酶回收率为10.25%。利用Sephacryl S-200分子筛层析Marker标准曲线以及反相酶谱法,初步判断CPI-I的分子质量为89kD。高碘酸-Schiff试剂(PAS)染色法证明该蛋白为糖蛋白。CPI-I能够抑制鲢鱼组织蛋白酶L,且具有显著的热稳定性。     

鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善鱼糜凝胶强度的效果研究

通过比较鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors,CPIs）粗提过程中的比活力（Azocasein法）,确定其最佳粗提条件为：以含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）的20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）作为匀浆缓冲液,并于30 ℃对匀浆样进行pH 3.0酸处理10 min,然后碱回调至pH 8.0,CPIs纯度提高了15.54 倍。进一步经SP Sepharose Fast Flow阳离子层析验证表明,与pH 4.0相比,pH 3.0酸处理能高效除去活性峰Ⅱ中的酸碱及热不稳定杂蛋白,使CPIs比活力提高了48.22 倍。采用SephacrylS-200分子筛层析,获得部分纯化的低分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c,比活力和纯化倍数分别为1 098.59 U/mg、312.10 倍和1 769.23 U/mg、502.62 倍。电泳分析表明,明胶底物-SDS-反相酶谱法无法鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c的抑制活性;而与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）则初步鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c中均含有至少7 kD和10 kD两种低分子CPIs。最后经质构分析表明,Ⅱ-b和Ⅱ-c以5 U/g添加入鲢鱼鱼糜时,均能够极显著提高鲢鱼鱼糜凝胶强度（48.77%和55.55%）,抑制软化。     

鲢鱼和草鱼下脚料中CPIs抑制活性比较及其分子量分布的鉴定

本研究首先确定偶氮酪蛋白(Azocasein)法和荧光合成肽法测定CPIs抑制活性的适宜反应体系,并证实Azocasein法更适合在鲢、草鱼下脚料(卵、皮)粗提过程中监测CPIs的抑制活性,而在层析过程中需采用高灵敏度的荧光合成肽法。Azocasein法测定表明,草鱼卵(349600units、332units/mg)和皮(25600units、87units/mg)中总活和比活均分别显著高于鲢鱼卵(10620units、3.98units/mg)和皮(3726units、14.14units/mg);同时,草鱼卵中CPIs抑制总活、比活均高于皮;鲢鱼卵中CPIs抑制总活高于皮,但抑制比活则低于皮;此外,根据Sephacryl S-200分子筛层析中活性峰位置,初步判断两种鱼卵和皮组织中均存在高(50~128ku)、低(7~19ku)分子量形式的CPIs,但明胶底物-SDS-PAGE反相酶谱中仅可见高分子CPIs形成的条带,而小于20ku的低分子CPIs均无法得到鉴定。     

热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化

探讨了热带假丝酵母中木糖醇脱氢酶的分离纯化工艺。分步采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶层析以及Hi Trap Blue HP亲和层析等纯化方法,得到电泳纯的木糖醇脱氢酶。经SDS-PAGE和native-PAGE分析表明,木糖醇脱氢酶分子质量约为90ku,由2个分子质量为45ku的亚基组成。最终酶蛋白纯化倍数达到60·8倍,回收率为10·9%。     

牛乳中具纤溶活性碱性蛋白酶的研究

通过ε-氨基己酸的解离作用,利用CM Sepharose Fast Flow凝胶过滤层析、Lysine-Sepharose(赖氨酸-琼脂糖凝胶)亲和层析的方法,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定,从末乳中分离出一种具有纤溶活性的碱性蛋白酶。采用凝胶色谱和等电聚焦法对其分子量和等电点进行测定。结果表明:该蛋白酶为单体蛋白,纯化倍数2.11,分子量为47.0 ku,等电点7.8。纯化后酶的活性可完全被PMSF抑制剂抑制,属于丝氨酸蛋白酶家族。对酪蛋白具有一定的水解能力。     

肠球菌素SAU-2 的纯化及其序列同源性分析

对产自肠球菌SAU-2的肠球菌素SAU-2通过盐析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析纯化,并用Tricine-SDS-PAGE确定细菌素分子质量;同时分析肠球菌素SAU-2序列与已知细菌素序列的同源性。结果表明：肠球菌素SAU-2纯化倍数为10.79倍,回收率为17.27%;分子质量约为4350D;肠球菌素SAU-2是细菌素家族的新成员,其基因序列、氨基酸序列与多数已知的肠球菌素同源性较低。     

鲢鱼肝脏中高分子CPIs提取方法的建立及其鉴定

研究了不同浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)、热处理条件及pH值对鲢鱼肝脏中高分子半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)提取过程中的作用,根据其对CPIs在TSK液相上高分子质量部分的蛋白峰值和比活力(荧光合成肽底物法)的影响,确定了最佳粗提条件为:以含5 mmol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),100mmol/L的Tris,3 mmol/L的EDTA(pH 7.5)作为提取缓冲液,而后在pH 8.7碱处理条件下经90℃加热5 min后,再回调到pH 7.0。用该法制备的鲢鱼肝脏CPIs粗提物经制备型Sephacryl S-200分子筛层析,分离得到的高分子活性部分,进一步经过反相酶谱法鉴定得到一种高相对分子质量的活性CPI,推测其可能是与某些蛋白结合形成了复合物,或是高分子CPIs的二聚体形式。     

蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

利用克隆表达技术,对一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01的亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase,NiR）基因进行克隆、原核表达,利用Ni柱亲和层析和DEAE Sepharose Fast Flow交换层析对表达的重组NiR进行纯化,分析重组酶的性质。研究结果显示,该NiR含有一个1?623?bp的开放阅读框,编码540?个氨基酸序列,重组NiR的分子质量约为67?ku;该酶中同时存在铁离子和铜离子,且含量分别为51.0?mg/kg和184.5?mg/kg;圆二色谱结果显示α-螺旋结构在重组NiR中所占比例最大。     

凝胶层析和离子交换层析结合法纯化重组降血压肽VLPVPR

为了提高VLPVPR的纯度,采用凝胶层析结合离子交换层析的方法对VLPVPR进行纯化。先用Sephadex G-10凝胶对VLPVPR溶液脱盐,再考察离子交换剂(SP Sepharose Fast Flow和Q Sepharose Fast Flow)对重组降血压肽VLPVPR的纯化效果,确立纯化VLPVPR的优化工艺。实验结果表明SP Sepharose Fast Flow不适于VLPVPR的纯化。采用Q Sepharose Fast Flow的纯化工艺为:上样量为柱床体积的10%,用10mmol/L pH9.0的CHES缓冲液洗脱,流速为1mL/min。VLPVPR回收率为93.8%,纯度达到47.2%。采用Q Sepharose Fast Flow纯化提高了VLPVPR的纯度。     

草鱼肝胰中CPIs初步分离鉴定及其活性测定

首先比较了偶氮酪蛋白(Azocasein)法和荧光合成肽底物法,在监测草鱼肝胰半胱氨酸蛋白酶抑制剂CPIs(cysteine proteinase inhibitors)活性时的适用性。进而通过凝胶过滤高效液相色谱法、反相酶谱和免疫印迹法,对草鱼肝胰中CPIs的分子量分布及可能的家族类型进行定性鉴定。结果表明在粗提液中加入丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂(40 mmol/L PMSF或0.4 mmol/L Pefabloc SC),或经90℃加热5 min,仅荧光合成肽底物法可准确地监测到CPIs活性的变化。液相色谱结果显示,草鱼肝胰中存在分子量(98、26、12、5~1 ku)不同的CPIs活性部分。但反相酶谱法仅能够判断其中大于20 ku的CPIs。而免疫印迹法证明存在约12 ku的Cystatin(家族II)类型CPIs,发现小于12 ku的显色条带,可能是该蛋白降解形成的低分子量的活性片段。     

白鲢鱼片在0 ℃贮藏条件下鲜度和品质的变化

以白鲢鱼为研究对象,以菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）值、pH值、色差值、三甲胺（trimethylamine,TMA）值、2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid,TBA）值为指标,结合电子鼻、质构和感官评价,探究0 ℃条件下鲢鱼片新鲜度变化规律。结果表明,在0 ℃条件下贮藏的鲢鱼片TVB-N值、TMA值、菌落总数值均随贮藏时间的延长而呈增长趋势;pH值先降低后增高;感官评分、硬度和弹性呈降低趋势;电子鼻可以对不同贮藏时间的鲢鱼片进行有效区分;色差值和TBA值对白鲢鱼鱼片品质的判断不具有参考价值。理化指标之间具有相关性,TVB-N值和TMA值与菌落总数值呈显著正相关（RTVB-N值=0.964、RTMA值=0.951）。0 ℃贮藏条件下鲢鱼片的货架期为12 d。     

植物乳杆菌胞外多糖的分离纯化及其乳化特性

在脱脂乳中分别培养植物乳杆菌菌株YW11和菌株SKT109,经三氯乙酸除蛋白、离心、乙醇沉淀、透析、冷冻干燥得到胞外多糖粗品,再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sepharose CL-6B凝胶柱纯化,得到两种胞外多糖纯品。利用气相色谱法分析此两种多糖的单糖组成,并采用KBr压片法观察红外光谱,利用动态光散射方法测定多糖的流体力学半径（Rh）。结果显示：YW11胞外多糖的单糖组成为葡萄糖、半乳糖,其物质的量比为3.45∶1,流体力学半径为69.20 nm;SKT109胞外多糖的单糖组成为葡萄糖、半乳糖,其物质的量比为1.43∶1,流体力学半径为41.74 nm;YW11胞外多糖的乳化能力强于SKT109胞外多糖,但前者的乳化稳定性略低;两种胞外多糖分别与其他乳化剂之间具有一定的协同作用,乳化颗粒的半径主要集中在1～2 μm之间。本研究获得的植物乳杆菌胞外多糖在食品加工中具有潜在的应用前景。     

刺参水煮液糖蛋白组成成分分析

目的：刺参水煮液是刺参加工过程中的副产物,通过对刺参水煮液营养成分的分析有助于将这种海产珍品加工废弃物转化为高附加值产品。方法：刺参水煮液经醇沉、透析、冻干,得到刺参水煮液糖蛋白（glycoproteinin sea cucumber boiling water,GSCB）粗制品;采用液相色谱和SepharoseCL-6B凝胶层析柱确定其糖蛋白组成成分及分子质量;采用液相色谱-质谱对1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP）衍生化的GSCB单糖组成进行分析;采用液相色谱法对其氨基酸组成进行分析。结果：GSCB主要含有2 种糖蛋白,分子质量分别为964.3 kD和2.5 kD。GSCB含有氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖6 种单糖;含有18 种氨基酸,其中含有8 种人体必需氨基酸,占氨基酸总量的38.38%。此外,半必需氨基酸组氨酸的含量在18 种氨基酸中占比最高,占比达到13.21%。结论：GSCB中含有酸性黏多糖物质,并含有多种必需氨基酸和半必需氨基酸,是一种良好的营养糖蛋白物质。对其深入开发将有利于变废为宝,开发出活性良好的功能保健食品。     

基于电子鼻和SPME-GC-MS联用分析脆肉鲩鱼肉的挥发性风味成分

以脆肉鲩鱼肉为原料,采用不同加热方式和加热温度,利用电子鼻对其挥发性物质进行识别,并对采集的数据进行主成分分析。采用固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术,对脆肉鲩鱼肉挥发性风味成分进行检测。结果表明：脆肉鲩鱼肉分别采用蒸、煮和烤3 种方式和不同温度条件下加热,电子鼻可以判别出不同加热方式和不同加热温度条件下的鱼肉,并达到显著水平。气相色谱-质谱联用仪分析显示确定脆肉鲩鱼肉挥发性物质主要是己醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、己醛、壬醛、2,5-辛二酮等化合物。     

鲢鱼与金线鱼混合鱼糜的凝胶特性

为研究鲢鱼与金线鱼混合鱼糜的凝胶特性,本实验对混合鱼糜凝胶的凝胶强度、持水性、蒸煮损失、白度值、横向弛豫时间、微观结构和肌原纤维蛋白进行分析。结果表明：混合鱼糜的白度值较纯金线鱼鱼糜显著提高（P＜0.05）,且鲢鱼鱼糜与金线鱼鱼糜质量比5∶1混合后的凝胶白度值高于纯鲢鱼鱼糜;此配比下的混合鱼糜凝胶性能最好,其中凝胶破断力、凹陷距离、凝胶强度和持水性较鲢鱼鱼糜分别提高了18.33%、27.29%、51.01%和5.65%,较金线鱼鱼糜分别提高了5.84%、19.50%、26.49%和3.45%;该配比下的混合鱼糜凝胶的蒸煮损失较鲢鱼鱼糜和金线鱼鱼糜分别降低了15.88%和7.48%。低场核磁共振分析显示鲢鱼鱼糜与金线鱼鱼糜质量比5∶1混合后的鱼糜凝胶的横向弛豫时间T22比鲢鱼鱼糜凝胶T22缩短了10.34 ms。通过扫描电镜观察发现鲢鱼鱼糜与金线鱼鱼糜质量比5∶1混合时可形成高度均匀、致密的空间凝胶网络结构。肌原纤维蛋白凝胶电泳图显示该配比下肌球蛋白重链（myosin heavy china,MHC）发生交联,大分子聚集体形成,进入凝胶中MHC更少,条带更细窄。     

鲢鱼各部位磷脂组分及脂肪酸组成分析

应用Bligh-Dyer法、硅胶柱层析和薄层层析（thin layer chromatography,TLC）分析比较鲢鱼头部、眼部、背肌、腹肌、内脏、尾部的磷脂含量与组成,气相色谱-质谱联用技术分析鲢鱼各部位磷脂的脂肪酸组成。结果表明：各部位磷脂种类有磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidyelserine,PS）及一未知组分,鲢鱼各部位的PE、PC明显高于其他磷脂组分。鱼头磷脂中饱和脂肪酸的总量最高,其次是内脏中含量,鱼眼中含量最低。单不饱和脂肪酸的含量也在鱼头中最丰富,明显高于背肌、鱼眼、腹肌、鱼尾,后三者间差异性不显著（P＞0.05）,内脏中含量最低。多不饱和脂肪酸的含量在鱼眼中最多,与腹肌、鱼尾中的含量差异不显著,都在49%以上,但明显高于鱼头、背肌内脏中的含量。各部位间内脏中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量明显高于其他部位,其次是鱼眼。鱼眼磷脂中C22∶6的含量最丰富,C20∶5在内脏磷脂中含量最多。     

鲤鱼中腐败希瓦氏菌生长模型的建立和验证

利用市售鲤鱼中分离鉴定得到的腐败希瓦氏菌进行了生长动力学模型的建立。通过预测微生物学的方法比较Logistic、Gompertz和Baranyi模型的生物学特性和应用特性,对3 种模型所得参数进而构建了二级模型并分别进行了内部和外部验证。结果表明：Logistic、Gompertz和Baranyi模型在内部验证中的r2分别为0.982 4、0.983 6和0.988 4,偏差因子（bias factor,Bf）分别为0.985 0、0.995 0和0.970 0;而外部验证Bf值分别为0.804、1.177和0.826。Baranyi模型在对微生物生长的预测性上不仅准确,而且能够更加有效地进行食品安全预警,在实际的农产品和食品领域具有很好的实用价值。     

不同宰杀方式对草鱼肉呈味水溶性成分的影响

以不同宰杀方式草鱼的背部肉为对象,采用高效液相色谱法和氨基酸自动分析法研究不同宰杀方式（自然、急杀、去鳃）对草鱼背部肉核苷酸类化合物和游离氨基酸含量的变化,并测定背部肉pH值、糖原和乳酸的含量。结果表明：自然、急杀、去鳃3 种宰杀方式的草鱼背肉苦味氨基酸含量占总游离氨基酸含量分别为78.95%、68.60%、69.44%,部肉的鲜度K值分别为20.28%、15.49%、12.13%,自然死亡组腺嘌呤核苷三磷酸含量最低,肌苷酸含量最低,鲜度最差。草鱼背肉中pH值的变化与乳酸含量的变化呈负相关,乳酸含量的变化与糖原含量的变化呈负相关,自然死亡的草鱼肉乳酸含量最高,pH值最低。不同宰杀方式对草鱼背肉呈味水溶性成分影响较大,自然死亡的草鱼肉滋味最差,急杀致死和去鳃致死组滋味差别不明显。因此,在加工过程中,要避免鱼血渗入肌肉,造成鱼肉土腥味产生。